肝脏疾病研究之【基因转导】技术

      肝脏是人体的代谢中心器官，参与代谢、分泌胆汁、能量转换、解毒、凝血、免疫等多个生理过程，与许多遗传性、代谢性、感染性疾病及肿瘤的发生和发展密切相关。肝脏代谢异常会导致多种疾病，例如肝炎、肝纤维化、肝硬化、脂肪肝、肝癌等，此外糖尿病、肥胖症、血友病等疾病也和肝脏代谢异常有关。如下图所示肝脏代谢主要可以分为以下几类：

肝脏代谢疾病主要是因为某些基因过度表达或表达不足，而基因治疗可以将外源基因导入有病变的细胞，通过转基因表达产物发挥功能从而达到治疗目的。

肝脏细胞包括实质细胞和非实质细胞两大类，肝实质细胞是指具有肝功能的细胞，而非实质细胞包括肝星状细胞、Kupffer（枯否式）细胞和血管内皮细胞等。研究表明肝脏实质细胞通过非实质细胞分泌的配体-实质细胞内受体-转录因子-靶基因组成的高维度相互作用网络来维持肝脏稳态。

由于肝细胞有强大的蛋白质合成和分泌功能，因此将外源基因转导肝细胞以调控其功能产物的合成和分泌等过程能达到治疗目的，是基因治疗有效的靶细胞，目前在临床上已有相关应用，例如治疗血友病和先天肝脏代谢异常。

目前应用于肝细胞的基因转导载体系统包括病毒载体系统和非病毒载体系统两种，与病毒载体相比，非病毒载体介导的基因递送转染效率低，并且有时会导致短寿命基因表达，截至2015年，病毒载体介导的基因转导占全世界基因治疗临床试验的70％左右。

病毒载体介绍

汉恒总结大量的文章数据和汉恒研发中心数据，对不同的病毒载体在体外和体内肝脏基因转导中的评分如下表所示。

小编整理了各种病毒工具的优缺点，供大家参考~

体外肝脏基因转导与病毒载体

用病毒载体介导体外肝脏基因转导可以选用腺病毒、慢病毒和AAV。汉恒公司分别用腺病毒、慢病毒、AAV-9感染原代肝细胞的结果如下图所示，可以看到腺病毒的感染效率最高，慢病毒次之，AAV-9感染效率相对最低。因此就感染效率而言，体外肝细胞基因转导首选腺病毒载体。此外AAV-DJ能广谱性感染多种细胞，感染效率高，也可以用来进行体外肝细胞基因转导。

图：体外不同的病毒载体介导原代肝细胞的基因转导（by 汉恒实验室）

体内肝脏基因转导与病毒载体

和病毒载体介导体外肝脏基因转导不同，用病毒载体介导体内肝脏基因转导需要考虑安全性、致病性、均一性、特异性、表达时长等因素。通过比较不同病毒载体介导体内肝脏基因转导的优缺点可知（如下图），AAV是体内肝脏基因转导研究中最安全、均一、长效、特异、高效的病毒载体，具有得天独厚的优势。

图：汉恒肝脏特异性AAV-体内肝脏基因转导的最佳病毒载体

汉恒利用荧光素报告技术对一些肝脏特异性启动子的不同片段进行不同长短体的严筛，尾静脉注射100μl，感染3周，小动物活体成像。筛选出利用TBG（Human thyroxine-binding globulin promoter，即TBG promoter，简写为TBG）肝脏特异性启动子可以实现用AAV对小鼠体内肝细胞的特异性感染，无非特异性脏器感染（如下图）

图：体内肝细胞基因转导-肝脏特异性AAV(AAV9-pTBG-Luc)体内感染效果图。（by 汉恒实验室）