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双萤光素酶检测试剂盒


双萤光素酶检测试剂盒

萤光素酶(Luciferase) :是自然界中能够产生生物发光的酶的统称,其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Firefly)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶,荧光素酶可以催化特定的荧光素底物转变成氧萤光素,同时发出强烈的光。

萤火虫萤光素酶(firefly Luciferase,F-Luc), 61kDa,可催化D-荧光素发出萤光

海肾萤光素酶(Ranilla luciferase,R-Luc), 36kDa,可催化腔肠素发出萤光


特点


1.底物存在时,催化底物发出萤光

2.萤光亮度和萤光素酶的量成正比

应用

miRNA和靶基因结合双萤光素酶验证方案

miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子,通过靶向结合目的基因的结合位点(通常位于基因的3端非编码区——3UTR区),抑制其上游基因的表达。

鉴于miRNA的特点及luc的特性。

miRNA及其靶结合位点的验证可以通过双荧光实验来实现,包括:

● miRNA与其靶点相关分析

● miRNA靶基因验证

● lncRNA与circRNA 吸附miRNA验证等



检测原理

把miR潜在结合构建到报告载体上F-Luciferase下游,将报告载体与 miR的mimics共同转染到细胞内测定荧光素酶值,分析F-Luciferase活性即可反应miRNA与结合位点的结合特性




检测方法及载体工具

把miR潜在结合位点上下游~500bp(he/或突变位点)构建到荧光素酶报告载体上psiCHECK2的F-Luciferase下游3UTR区,载体上持续性表达R-Luciferase元件作为内参, 与miR的mimics(小片段双链miRNA )/ NC共同转染293T细胞共同转染到细胞内测定荧光素酶值,分析F-Luciferase活性即可反应miRNA与结合位点的结合特性




miRNA及靶点验证F-Luciferase报告载体


产品规格


实验步骤

一、细胞转染

转染48 h后收集样检测。

二、荧光检测

1.      将培养箱中的24孔板取出,放在室温,至细胞平衡到室温。

2.      加入细胞裂解液Lysis Buffer,充分裂解后12000rpm 4℃离心10min并转移至96孔板中。

3.      每孔加入F-Luc底物试剂,放入酶标仪中测定记录Firefly luciferase值。

4.      每个孔中加入Stop solution终止F-Luc反应并淬灭F-Luc荧光

5.      每孔加入R-Luc底物放入酶标仪中测定记录Renillaluc luciferase值

6.      计算Firefly luciferase相对荧光值F-Luc/ R-Luc




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