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lncRNA与microRNA的靶点验证服务


简介:


lncRNA的作用机制有很多,以ceRNA(competing endogenous RNA,竞争性的内源RNA)形式发挥功能是其中的一种,即lncRNA与靶基因的3’UTR竞争结合相同的microRNA,降低microRNA对靶基因的抑制功能,从而上调靶基因的表达量。为了检测其效果,我们可以用Western Blot检测靶蛋白的表达水平,也可以用qRT-PCR检测靶基因的表达。但是这两种方式都无法确定lncRNA是否通过ceRNA方式调控靶基因的表达。因此,我们可以通过“microRNA与lncRNA结合验证”,“microRNA与靶基因结合验证”和“lncRNA与靶基因3’UTR竞争结合microRNA验证”实验,构建Sensor reporter并进行活性检测,对lncRNA,microRNA与靶基因这三者间的作用机制作出准确判断。



服务优势:


(1)利用专业软件进行miRNA与lncRNA和靶基因3’UTR区的结合位点预测;

(2)采用Promega公司特有psiCHECK质粒;

(3)所采用的Luciferase双荧光报告系统,可以获得宽泛的线性定量范围与极高的灵敏度;

(4)采用瞬时转染技术,操作简便、快速,周期短,适用于绝大多数细胞类型。



服务流程:


一、microRNA与lncRNA结合验证

(1)直接合成靶lncRNA序列或microRNA在靶lncRNA上的结合位点序列;

(2)将上述合成的DNA片段克隆至报告基因载体psiCHECK质粒;

(3)购买microRNA mimics;

(4)将报告载体与microRNA mimics共转染293T细胞;

(5)多功能酶标仪检测报告基因的表达水平;

(6)数据分析,整理提交客户原始数据及项目报告;

注:为了实验的严谨性,可加入靶lncRNA序列中microRNA预测结合区域的突变体作为对照,进一步说明问题。


二、microRNA与靶基因结合验证

(1)直接合成靶基因3’UTR序列或microRNA在靶基因3’UTR上的结合位点序列;

(2)将上述合成的DNA片段克隆至报告基因载体psiCHECK质粒;

(3)购买microRNA mimics;

(4)将报告载体与microRNA mimics共转染293T细胞;

(5)多功能酶标仪检测报告基因的表达水平;

(6)数据分析,整理提交客户原始数据及项目报告;

注:为了实验的严谨性,可加入靶基因3’UTR区microRNA预测结合区域的突变体作为对照,进一步说明问题。


三、lncRNA与靶基因3’UTR竞争结合microRNA验证

(1)直接合成靶基因3’UTR序列或microRNA在靶基因3’UTR上的结合位点序列;

(2)将上述合成的DNA片段克隆至报告基因载体psiCHECK质粒;

(3)直接合成lncRNA序列,构建lncRNA过表达质粒;

(4)将报告载体与lncRNA表达载体共转染293T细胞;

(5)多功能酶标仪检测报告基因的表达水平;

(6)数据分析,整理提交客户原始数据及项目报告;

注:为了实验的严谨性,可加入靶基因3’UTR区microRNA预测结合区域的突变型报告载体及lncRNA序列中microRNA预测结合区域的突变型表达载体作为对照,进一步说明问题。


参考文献:

Cesana, M., et al. (2011). "A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA." Cell 147(2): 358-369.



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