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WB实验


Western Blot(WB),即蛋白质印迹法(免疫印迹试验)。


它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。


蛋白质印迹法是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所(Friedrich Miescher Institute)的Harry Towbin在1979年提出的。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot。蛋白免疫印迹(Western Blot)是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。


原理


与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似,但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。



【操作步骤】


一、蛋白样品准备

收集蛋白样本,加入蛋白上样缓冲液混匀,100℃加热5 min,充分变性蛋白。


二、电泳与转膜

1,SDS-PAGE凝胶制备;

2,取适量样本上样,先在浓缩胶中用100-120 V电泳跑胶至分离胶,后增加电压到120-150 V电泳至目的蛋白已经最大化的分离;

3,电泳结束,将分离胶转移至预冷的转膜液中,200-250 mA恒流转膜2 h。


三、蛋白杂交及显色

1,洗膜:转膜结束后,将蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中,直至洗膜液洗尽;

2,封闭:将膜小心放入封闭液中,摇床上轻微摇晃,室温下封闭 1-1.5 个小时,或4℃ 封闭过夜;

3,一抗孵育:吸尽封闭液,加入稀释好的一抗,室温摇床上孵育1.5小时或者4°C孵育过夜;

4,二抗孵育:将膜转移至稀释好的二抗,室温下杂交1-2小时。

5,EC化学发光,显影,定影,将胶片进行扫描或拍照。



实例展示


(Xu S , Wang P , Zhang J , et al. [J]. Molecular Cancer, 2019, 18)


本研究通过全转录组测序,筛选并锁定长链非编码RNA EGOT作为研究靶标。通过实验表明EGOT能增加乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性,并且在机制上雌激素通过ER-NRIP1-AP1三元复合体,转录抑制EGOT的表达,从而增加肿瘤细胞自噬水平并提高对紫杉醇的敏感性。



参考文献:


Dennis-Sykes, Carolyn A., William J. Miller, and William J. McAleer. "A quantitative Western Blot method for protein measurement." Journal of biological standardization 13.4 (1985): 309-314.

Rawlins, Mindy L., et al. "Evaluation of a western blot method for the detection of Yersinia antibodies: evidence of serological cross-reactivity between Yersinia outer membrane proteins and Borrelia burgdorferi." Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12.11 (2005): 1269-1274.

Griffiths, Steven G., et al. "Comparison of western blot, direct fluorescent antibody and drop-plate culture methods for the detection ofRenibacterium salmoninarum in Atlantic salmon (Salmo salar L.)." Aquaculture 97.2-3 (1991): 117-129.

Liu, Chengyi, et al. "Roles of autophagy‑related genes Beclin‑1 and LC3 in the development and progression of prostate cancer and benign prostatic hyperplasia." Biomedical reports 1.6 (2013): 855-860.


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