汉恒生物-慢病毒载体-腺相关病毒包装-自噬-双荧光素酶-转染试剂-细胞支原体污染-无缝克隆-cas9-稳定细胞株-IncRNA-环状RNA

汉恒高滴度逆转录病毒免费试用活动

髓系细胞：K562 U937 THP-1 L1210 HL-60 ……

淋系细胞： A3 Supb15 Reh Jurkat ……

NK系：NK92

原代细胞：造血干(LSK) 原代T，B，NK,PBMC

你还在为转染这些细胞而苦恼吗？
汉恒高滴度逆转录病毒轻松搞定！

汉恒生物现推出逆转录病毒试用装申请免费活动

试用装规格

【限量100份（GFP），体积50ul 】

【滴度不低于1x10的8次方TU/ml 】

汉恒还可根据客户具体需求给出特定的逆转录试用装。

一、逆转录病毒试用装的分装与贮存

1.收到汉恒生物逆转录病毒产品后，请先对逆转录病毒产品进行分装处理，建议20-50μl/管。如1-2天内使用，则留足够量病毒4℃保存，余下逆转录病毒置于-80℃长期保存。

2.病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过 6个月，建议在使用前重新测定病毒滴度。

3.反复冻融会降低逆转录病毒滴度：逆转录病毒滴度越低，冻融对滴度的影响越大，^₁₀₈TU/ml的逆转录病毒冻融2次滴度没有显著性差异，第3次冻融开始，每冻融一次滴度降低约10%。

二、逆转录病毒试用装的实验策略与关键知识点

1.逆转录病毒感染策略

逆转录病毒本身的病毒滴度不高，感染细胞时病毒消耗量较大，试用装体积较小，建议使用96孔板进行MOI梯度感染测试。逆转录病毒感染细胞后会反转录并插入基因组形成稳转，因此逆转录病毒感染一般采用感染少量细胞，然后将细胞放大化培养。而不是直接大量感染。

注意：对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用腺病毒感染。

2.逆转录病毒感染关键知识点

1）细胞准备：由于试用装体积有限，请使用96孔板准备细胞，逆转录病毒感染细胞前，请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。逆转录病毒感染的时候细胞汇合率为40%～60%间为宜。

2）感染细胞最佳MOI的测定：MOI（感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。

逆转录病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别，原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。MOI一般以3，10，30，100的比例递增进行梯度摸索，一般的细胞基础逆转录病毒感染MOI可从3为开始，即设立4个常规的MOI摸索，即3，10，30，100。

3) 助转剂polybrene的选择：实验证明，polybrene可提高逆转录病毒对大部分细胞的感染效率，但polybrene有一定的细胞毒性，不同细胞对polybrene的敏感度不同，polybrene最常用的工作浓度为5～8μg/ml。

4）MOI对应病毒体积的换算（非常重要）

感染时细胞数（一般以传代计数细胞数×2计算）×MOI=病毒个数；则加入的病毒体积数=病毒个数/病毒滴度。

三、逆转录病毒感染细胞步骤：（1/2小体积感染法）

1.感染前准备

1）按实验需要将细胞铺96孔板，37℃ 培养过夜。细胞数以第2天密度约40%～60%间为宜。

2）从冰箱取出逆转录病毒并在冰上缓慢融化，待完全融化后开始病毒感染实验。

2. 目的细胞的感染(1/2体积4小时感染法）

1）吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基，并往新鲜培养基里加入终浓度5～8μg/ml的polybrene(部分polybrene不耐受细胞除外），再根据选定的MOI值，换算对应的病毒原液体积，并按体积将病毒原液加入细胞中，摇匀。

1/2体积4小时病毒感染体积表
培养皿类型	表面积/cm²	1倍细胞培养基体积	1/2培养基体积
96-well	0.3cm²	100μl	50μl
24-well	2cm²	500μl	250μl

2）针对贴壁细胞，细胞中加入病毒液后直接置于37℃培养箱感染4小时。

3）若目的细胞是悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法进一步促进病毒对细胞的感染性吸附，即将适量的病毒液加入细胞培养板后，封好口，放入平角离心机后，低速（300g）离心1h，然后放入37℃培养箱中继续积感染3小时。

4）37℃培养箱中感染完毕后，取出细胞，直接往含病毒的培养基中加入另外1/2体积新鲜培养基（含终浓度5～8 μg/ml的polybrene，部分polybrene不耐受细胞除外）。

5）感染后第二天（约12-16小时），吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液（不含polybrene），继续37℃培养。

6）感染72小时后，荧光显微镜检测GFP等荧光表达效率，确定最适MOI。

7）稳转株的初筛选：如病毒载体携带puromycin抗性，感染72小时后置换含适当浓度的puromycin（1～3 μg/ml）的新鲜完全培养液，同时准备一组普通目的细胞（简称Blank组，其细胞数量、密度和病毒感染组细胞一致），加入等终浓度的puromycin。每2-3天换含puromycin的完全培养液一次，直到Blank组细胞被puromycin杀光。

8）稳转株的二次筛选与培养放大：将puromycin终浓度减半（简称：1/2 puro培养基）培养存活的病毒感染组的细胞（包括目的基因和对照病毒组），并在细胞长密到80%左右进行细胞传代，传代后的细胞为P2代稳转株，P2代-P4代继续用1/2 puro培养基培养细胞，大量扩增细胞至4代，并大量冻存P4代的稳转细胞株，以备后续实验。