心血管

如何体内进行心肌疾病相关基因的功能研究？这包含疾病模型的选择、基因转导病毒工具的选择、以及病毒注射方式的选择等几个关键问题。分述如下：

一、心肌功能研究常用的动物模型

1、在体动物模型（in vivo）：

心肌相关研究模型包括：

① 心力衰竭——主动脉弓缩窄心衰模型（TAC），通过结扎冠状动脉前降支或前降支分支使主动脉口径缩小，以加重心脏后负荷， 在心肌肥厚模型形成后，可发展为心力衰竭。

② 心肌梗死——心肌缺血再灌注，心脏冠脉左前降支（LAD） 结扎使血管缺血一段时间，再松开使血液回流，造成再灌注二次损伤。

2、更新微信推送数据离体模型：Langendorff 心脏离体灌流模型

3、体外细胞模型：

① 细胞种类：新生鼠心肌细胞（1-3day）；成年心肌细胞（Langendroff 分离，分离难度大，培养困难）；H9C2 细胞系。

② 细胞造模：模拟缺血液，模拟缺氧环境。

汉恒心肌研究技术团队有完善的心肌细胞分离培养（包括新生和成年）经验。

具体造模方法详询汉恒生物。

二、心肌研究的病毒工具选择

目前主流的三大病毒载体：慢病毒、腺病毒、AAV（腺相关病毒）。对于心肌研究来说，AAV 病毒载体是最适合的研究工具。


表 1. 心肌功能研究病毒工具比较

慢病毒：病毒滴度较低，较少用于动物活体实验；心脏不易被感染，因此不能用来感染心脏。

腺病毒：载体容量最大，可达 6kb，感染 3 天后即可观察；免疫原性高，必须原位注射才可以；分子较大，会被体内防御系统识别进而清除，因此表达周期只有 2～3 周。一般目的基因比较大，试验周期短，才会选择此种方法。

腺相关病毒：很小，易于扩散，具有均一性；这一特点也使得不易被免疫系统发现，免疫原性低，安全性高，能持续在体内表达 3～6 个月，具有长效性；而且可以选择特殊血清型 AAV1/6/9 感染，相对特异性强；可以直接静脉；主流杂志一致认可，可提高文章分值档次，大文章必备。

图 1. 不同血清型 AAV 感染小鼠心脏组织。cTnT-EGFP 包装进 AAV 衣壳血清型 2,1,6,8,9 后分别通过颈静脉注射 1 周龄小鼠，4 周后检测小鼠心脏组织 EGFP 荧光（Gene Therapy. January，2011）。

汉恒心肌特异性 AAV --在体心肌的最佳基因载体

目前，AAV9 是公认的高效特异性靶向心脏表达的病毒载体血清型（图 1）。尽管 AAV8 的感染效果也不错，但是没有 AAV9 的扩散性好。无论是 AAV1/6/9 中的哪种血清型，都不能在心脏部位特异性表达。除了心脏外，AAV1 还可能在肌肉、骨骼肌、神经组织表达；AAV6 还可以在肺部表达；AAV9 还可以在肌肉、中枢神经、肺、肝脏表达。

汉恒心肌特异性 AAV，通过 AAV9，优选心肌特异性启动子和其他分子元件，实现心肌的高效基因转导：

① 高感染表达率：汉恒强启动子载体 AAV9，通过静脉注射，高效感染心肌，特异性上略差。

② 高心肌特异性 AAV：汉恒对 cTNT，cTNI，alpha-MHC，MLC2v 等启动子不同片段进行不同长短体的严筛，确定 cTNT 特异性启动子，高特异的表达与心脏。心脏中起始 cTNT 正常转录的元件较多，因此在心脏中相对表达量较其他部位高出很多。这里的表达是相对的，也就是说其他部位也可能会表达目的基因，但是跟心脏的表达量相比，可以忽略不计（图 2）。

图 2. 心肌特异性启动子表达效果图。小动物活体成像表明 cTNT 主要介导基因在心脏表达，虽然在肝脏中有些微渗漏。

③ 对实验要求极其严格（苛刻）：载体含有 Cre 依赖的 DIO 元件。DIO 原件的载体只有在 Cre 动物模型中才会表达。因此，只需用心脏 Cre 敲入动物，含有 DIO 元件的载体便能在心脏特异表达。

三、病毒注射方式

对于心脏来说，慢病毒无法发挥作用；腺病毒能原位注射；而腺相关病毒适合原位注射和系统性注射，如尾静脉注射（带有特异性启动子）和眼眶静脉注射（带有特异性启动子）。

① 心肌原位注射：直接注射是通过注射器或类似装置直接注入心脏肌肉组织。该载体通过间质空间获得心肌细胞，并通过特定的载体机制进入，在转导方面更具地方性。有些实验要求特异性比较高，只能在心脏处观察，其他部位是不可以观察到病毒表达的。那么这种情况下我们建议大家采用原位多点注射方式。因为心肌细胞的分裂能力比较差，所以采用此种方式注射的病毒不会扩散到其他部位。但是这种方法有一个弊端，需要采用开膛手术，对操作者要求比较高，而且动物伤害性比较大（图 3）。

图 3. 小鼠心脏原位病毒注射与效果示意图。左图是通过开胸对心脏进行原位病毒注射。右图是原位注射 AAV-GFP 3 周后效果图。通常采取原位多点注射的方式。

② 尾静脉注射：从动物尾部的静脉注射病毒，以输送到心脏和整个循环，包括冠状循环。该载体通过心脏毛细血管网进入大多数心肌细胞，是最简单的一种注射方式（图 4）。

图 4. 尾静脉注射 AAV 与心肌感染效果示意图

③眼眶静脉（temporal vein）注射：有些动物比较小，比如新生小鼠，尾静脉太细致使无法正常进行尾静脉注射。通过眼眶静脉注射同样可以传输到全身（图 5）。

图 5. 眼眶静脉注射示意图

对于更小的动物，如新生鼠可以通过眼眶静脉注射。效果跟尾静脉类似。

此外，对于血管相关疾病如动脉粥样硬化、高血压等及其引发的内皮损伤等功能研究通常也可以通过 AAV 来实现。如血管外膜 AAV 基因转导（图 6）。

图 6. 血管外膜 AAV 基因转导方法

血管剥离，然后用 matrigel 包裹，并涂抹适量 AAV 使之扩散感染到血管外膜。图中结果表明 AAV5 效果较好。对于血管内皮则不适用这一方法。