肌肉/脂肪

我们常遇到的肌肉疾病主要包括杜氏肌营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy, DMD），Becker 型肌营养不良（Becker Muscular Dystrophy, BMD）, 脊髓性肌萎缩（spinalmuscularatrophy, SMA）和肌萎缩性侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）等。

DMD 和 BMD 都属于 X 染色体隐性遗传，Duchenne 型发病率最高，病情最严重，是遗传性肌萎缩症中最有代表性的疾病。DMD 也是人体最大的基因，由 DMD 基因功能丧失引起，可以通过基因治疗技术手段治疗。SMA 是常染色体隐性遗传，由 SMN 基因缺陷、运动神经元丧失引起，可以通过基因治疗的方式来治愈，多发生在婴幼儿。ALS 也称为运动神经元病（MND），它是上运动神经元和下运动神经元损伤之后，导致包括球部（即延髓支配的这部分肌肉）、四肢、躯干、胸部腹部的肌肉逐渐无力和萎缩，病因至今不明。

神经肌肉萎缩患者大部分是缓慢起病，神经肌肉萎缩患者往往出现四肢肌肉无力、萎缩，也可有麻木、易疲劳 、肌肉疼痛等症状；有的患者还有眼肌、咽喉肌的无力，出现视物重影、眼球活动障碍、发音和吞咽困难等症状，严重者无法吞咽，甚至可能因呼吸肌无力而死亡。

1、这些疾病中主要集中在 DMD 和 SMA 疾病，模型分别为：

DMD：DMD 小鼠模型 mdx 小鼠，原理为：编码抗肌萎缩蛋白基因的第 3185 位基因自发突变，由 C-T，致使原本编码谷氨酰胺的密码子变成了终止密码子，基因表达提前终止，导致 DMD 功能缺陷。

SMA: SMA 模型鼠，通常是 SMN1 和 SMN2 双基因缺陷小鼠。

ALS：SOD1 突变相关的 ALS 小鼠模型（比如突变 SOD1 转基因小鼠等）

2、疾病模型干预处理-病毒选择 

目前主流的病毒载体三大金刚：慢病毒、腺病毒、AAV（腺相关病毒）。

表 1：三种病毒的应用比较 

慢病毒：感染表达范围广泛，对培养的肌肉细胞均能高效表达，但是对肌肉组织的感染表达非常有限。

腺病毒：载体容量最大，可达 6kb，感染 3 天后即可观察；免疫原性高，必须原位注射才可以；分子较大，会被体内防御系统识别进而清除，因此表达周期只有 2-3 周。一般目的基因比较大，试验周期短，才会选择此种方法。

腺相关病毒：（在体实验的最佳选择）腺相关病毒很小，易于扩散，具有均一性；这一特点也使得不易被免疫系统发现，免疫原性低，安全性高；能持续在体内表达 3-6 个月，具有长效性；可以选择特殊血清型 AAV1/2/9 感染，相对特异性强；可以直接静脉注射；也可以肌肉原位注射。主流杂志一致认可，可提高文章分值档次，大文章必备。缺点： 片段容量小、表达到高峰所需的时间长。

3、AAV 血清型选择 

目前靶向肌肉的 AAV 载体血清型主要为 AAV1、AAV2 和 AAV9。其中，AAV9 的表达效率最高，并且更容易在肌肉中高表达。

需要注意的是，无论 AAV1/2/9 中的哪种血清型，都不能在肌肉组织特异性表达。除了肌肉外，AAV1 还可能在肌肉、骨骼肌、神经组织表达；AAV2 可以感染肝脏等；AAV9 还可以在肌肉、中枢神经、肺、肝脏表达。

汉恒肌肉特异性 AAV，通过 AAV9 优选肌肉特异性启动子，实现肌肉的高效基因转导：

① 高感染表达率：汉恒强启动子载体 AAV9，通过静脉注射，高效感染肌肉，特异性上略差。

② 高肌肉特异性 AAV：汉恒经严密筛选，确定肌肉特意的 MCK 特异性启动子，高特异的表达于肌肉组织。肌肉中起始 MCK 正常转录的元件较多，因此在肌肉中相对表达量较其他部位高出很多。这里的表达是相对的，也就是说其他部位也可能会表达目的基因，但是跟肌肉的表达量相比，可以忽略不计。

4、注射方式

对于肌肉来说，慢病毒跟腺病毒均不推荐。我们强烈建议使用 AAV 作为在体肌肉基因转导的工具。常见的注射方式有原位注射和尾静脉注射（带有特异性启动子）。

肌肉原位注射（图 1）：直接注射是通过注射器或类似装置直接注入肌肉组织，可以在注射点附近高效表达，但缺点是病毒扩散十分有限，因此往往需要多点注射，一般每个点在 10-15ul。通常 CMV、CAG 等启动子在肌肉组织中具有较高的表达效率，如果要实现肌肉组织的特异性表达，可以采用定点的递送方式达到。

图 1 小鼠肌肉原位注射效果图 

选用 8 周龄 C57 小鼠原位多点注射骨骼肌。（A）。 AAV9-LUC 感染 4 周后活体成像。病毒滴度：1*1012v.g/ml，10ul/点，4 个点。（B）。 AAV9-GFP，感染 4 周后冰冻切片荧光显微镜检测。病毒滴度：1*1012v.g/ml，10ul/点，4 个点。

尾静脉注射（图 2）：从动物尾部的静脉注射病毒，以输送到全身各处肌肉。这种方式病毒表达较均匀，但是大部分会被其他脏器组织吸收，导致靶向肌肉的病毒较少。因此这种注射方式需要带有肌肉特异性的 MCK 启动子来驱动目的基因表达。

图 2. 通过尾静脉注射感染小鼠腓肠肌示意图

a 图是 AAV 介导的、用 MCK 特异性启动子驱动外源基因表达的效果图；b 图是 mdx 小鼠的对照（Wang, B., et al. 2000, PNAS）。