如何研究自噬Part4：基因操作在自噬研究过程中的应用

前期回顾

PART1:自噬的概念及自噬切入角度

PART2:自噬的“黄金标准” 及调控自噬流的方法

PART3：自噬领域的金牌研究工具

PART4

基因的操作在自噬研究过程的作用

很多情况下，为了研究自噬参与某个生物学过程的机制，比如要证明某种处理（药物、基因等）通过改变自噬流进而影响某种表型，我们可以敲除掉自噬关键基因的细胞系抑制自噬流的形成，再用该处理处理细胞，则应该看不到表型的变化，或者变化会相应的减弱。这样的实验设计可以证明自噬确实参与或影响该种表型。

在这种背景下，研究者往往会选择参与自噬囊泡形成的相关基因，如    ATG5\ATG13\ATG16L1\SQSTM1\ATG7\ATG14\RB1CC1\ULK1\ATG12等，进行干预。其中，ATG7作为泛素样激活酶（E1-like）、ATG10作为泛素样结合酶E2（E2-like）依次参与催化ATG12共价连接到ATG5。 ATG12-ATG5共价复合物一起作为泛素样连接酶E3（E3-like）催化ATG8（LC3）家族蛋白的剪切、脂化（共价连接到自噬小体的膜上），最终参与自噬囊泡的形成（图1）。

图1，调控自噬的主要信号通路。

所以，如果干扰ATG5、ATG12、ATG7或者ATG10等核心基因的表达，会显著抑制自噬囊泡的形成，抑制自噬流的发生。实例如图8，野生型的U2OS-LC3-GFP细胞内，使用氯喹抑制溶酶体活性会显著增加自噬小体的数量；但对于转染LC3-GFP ，并且敲除ATG5基因的U2OS-细胞，无论是否用氯喹处理，均观察不到明显的自噬小体。这提示ATG5在自噬体形成过程中扮演重要的角色。

图2，U2OS细胞敲除自噬关键基因ATG5后会抑制自噬。在野生型和ATG5敲除的U2OS细胞中转染LC3-GFP病毒48hr，然后用15 μM chloroquine 再处理 24 hr，指示自噬体的绿色小点的数量明显减少。

除了主流的定位示踪工具LC3和P62之外，汉恒公司还拥有多种自噬相关基因的过表达载体，常见的ATG5、ATG10、ATG7、ATG12、ATG13、ATG16L1、ATG14、RB1CC1（即ATG17）、ULK1（即ATG1）、以及线粒体相关基因Parkin、Bnip3、Nix、FUNDC1等，每个基因均有过表达的质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒现货，包含人、大鼠、小鼠等常见物种。

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除了以上的以降解非特异性的细胞质内容物为特点的经典自噬外，研究人员也越来越关注细胞器参与的选择性自噬，包括线粒体自噬、脂滴自噬 、核糖体自噬、过氧化物酶体自噬、染色体自噬等。其中最具代表性的例子就是线粒体自噬（Mitophagy）。

线粒体自噬是细胞在应对氧化应激等压力条件下一种基本的生物学现象，通常会把多余的或者受损的线粒体通过自噬途径降解掉，从而维持细胞内稳态。一个事实：如果细胞线粒体发生自噬，则线粒体一定会和自噬小体有空间上的接触。如用线粒体解偶联试剂CCCP处理细胞会显著诱导细胞发生线粒体自噬。

所以，基于这种合理的假设，我们只需分别标记线粒体和自噬小体，然后观察二者有无共定位，从而判断有无线粒体自噬或线粒体自噬强弱。

如下图3所示，我们用自噬小体单标工具LC3-GFP标记自噬小体，用mito-RFP标记线粒体。我们发现chloroquine处理会显著增加线粒体和自噬小体的共定位，说明该过程有线粒体自噬发生。不仅可以检测离体细胞的线粒体自噬，LC3-GFP和mito-RFP标记工具也可以用来检测活体动物的线粒体自噬。

图3，线粒体和自噬小体的共定位。用mito-RFP（红色）和LC3-GFP（绿色）分别标记自线粒体和噬小体。其中上排A代表对照，下排B代表用CCCP和Chloroquine处理。

类似的，我们可以通过观察他细胞器跟LC3-GFP共定位的情况来考察这些细胞器在某些处理条件下是否参与自噬的发生。常见的还有内质网ER、高尔基体Golgi、脂滴、染色体等（图4）。

图4，LC3-GFP标记的自噬小体和RFP标记的其他细胞器的关系。A549细胞转染LC3-GFP与（A）线粒体定位的RFP（mito-RFP）、（B）高尔基体定位的RFP（Golgi-RFP）、（C）溶酶体定位的RFP（Lyso-RFP）、（D）ER定位的RFP（ER-RFP），分别指示了线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网与参与自噬的发生。

汉恒生物拥有多种细胞器定位的工具病毒现货，包含：线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网等，可以和LC3单荧光标记的腺病毒（AD-GFP-LC3）配合使用，用来观察细胞器的自噬情况：

今天的内容就是这些，下期我们将介绍：其他细胞器的自噬研究和自噬流荧光数据的处理。

   我们下期见。