自1998年Fire和Mello首次提出RNAi(RNA interference，RNA干扰) 概念以来，越来越多的人开始重视小RNA的研究，之后RNAi在基因功能的研究中也得到广泛应用。RNAi是一种存在于真核生物中的转录后基因沉默现 象，在生物进化过程中能够抵御病毒感染及防止基因组中由于逆转座子元件扩增引起的不稳定。
在miRNA(microRNA)、siRNA(small interfering RNA) 等小RNA的介导下，RNAi能够特异性地调控mRNA基因在表观遗传学水平、转录水平及转录后水平的表达。
如何设计siRNA
小干扰RNA(Small interfering RNA;siRNA)与靶向特异性的mRNA结合，通过RNA介导的沉默复合体RISC(RNA-induce siliencing complex)介导mRNA的降解。siRNA长度一般为21-23nt，被RISC识别结合之后，siRNA 发生解旋。RISC在siRNA的反义链指导下，寻找具有同源序列的内源性的mRNA，并在距离5’端10-11位碱基之间切割mRNA，从而导致转录后基因沉默。
siRNA设计原则
RNAi最终要通过siRNA片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA序列，是决定RNAi特异性的关键所在，也是siRNA设计的基本原则。从具有不同沉默效率的siRNA序列中 筛选出高效的siRNA序列，需要经过严密的设计和不断的实验检验。下面我们就来看下siRNA设计要遵循哪些原则：
1.siRNA序列在靶基因中的位置
从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好。
2. siRNA序列的起始碱基与长度
SiRNA序列最好为AA(N n)UU(N 代表任意碱基;n为碱基数目，在19～29 nt之间)， NA(N n) UU和NA(N n) NN序列也可以。最新研究表明 ，27 nt或29 nt的siRNA与21 nt siRNA相比27 nt SiRNA对靶基因的最大抑制率可在相对低的浓度下得到。
3 .siRNA 3′端突出碱基的选择
建议用dTdT取代3′端的2 个碱基突出，增强siRNA 双链复合体的稳定性。
4 .siRNA序列中G/ C含量的选择
G/C含量在30%～52%的siRNA序列，其沉默基因效果较好。
5 .siRNA 中应避免连续的单一碱基和反向重复序列
因为连续2个以上的G和C可以降低双链RNA 的内在稳定性，从而抑制RNAi作用；连续3个以上的U和A可能终止由RNA Polymerase III介导的转录。siRNA序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构，这种结构的存在可以降低siRNA的有效浓度和沉默效率。
6 .siRNA双链的内在稳定性
反义链5’端的第一个碱基尽量为A或U;siRNA正义链的5’端第一个碱基尽量为G或C。
7. siRNA正义链的碱基偏爱性
正义链的第一位和第十九位碱基为A;正义链的第十位碱基为U;正义链的第十三位碱基不为G;正义链的第十九位碱基不为G或C时，siRNA 序列具有较高的基因沉默效率。
8 .siRNA 序列的特异性
目前没有发现siRNA的干扰效率与mRNA中具体位置的关系，为确保对靶mRNA的有效抑制，针对每一个靶基因结合上述siRNA设计原则选择靶点相差25bp以上的4星半以上的至少3条序列。
siRNA设计步骤
首先在NCBI上找到靶基因的目的片段，如果靶基因有多个转录本就需要把所有NM号所对应的CDS序列放在 clone Manager中比对，并选择拥有序列CCDS进行设计。 siRNA有很多在线设计工具。下面列出了4个siRNA设计，我们以小鼠的Map2k1在thermofisher上设计siRNA 为例。
siDirect设计网站
DSIR设计网站
http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.htm
invivogen设计网站
http://www.invivogen.com/sirnawizard/siRNA.php
thermofisher设计网站
https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.do?designO
我们通过NCBI找到小鼠Map2k1有一个转录本NM_008927.4，将NM号或者CDS序列复制到thermofisher网站中，如下图所示。
目前没有发现siRNA的干扰效率与mRNA中具体位置的关系，为确保对靶mRNA的有效抑制，针对每一个靶基因结合上述siRNA设计原则选择靶点相差25bp以上的4星半以上的至少3条序列。随后将siRNA片段进行Blast
分析，尽量选择与靶基因特异结合的序列，进行化学合成后，通过实验筛选出沉默效率最高的siRNA 序列进行下一步的基因功能研究。
PS:需要注意的是，有的siRNA序列在设计时没有遵守这些指导方针，实验证明也具有很高的干扰效应，这表明，我们只能根据上述指导方针设计出理论上具有较高沉默效应的siRNA序列，siRNA的最终活性需要用实验来验证 。
小片段RNA如何进行转染呢
目前市面上大多数转染试剂都是针对比较大的质粒DNA而非小RNA分子。但是转染DNA的转染试剂和方法不完全适用于转染siRNA、miRNA等小片段RNA。
并且siRNA转染比DNA转染对转染试剂细胞毒性的要求更严格。对于以研究基因干扰为主的RNAi实验来说，因为细胞死亡和RNAi实验造成的结果在现象上是一致的，轻则影响实验数据，重则改变实验结果。
因此RNA干扰实验首先要求选择适合转染小RNA的高效转染试剂，其次要求转染试剂本身的细胞毒性很小，比如选择汉恒生物RNA专用转染试剂——RNAFit
在绝大多数的细胞(如HeLa，MCF7或NIH-3T3)中使用RNAFit转染1 nM siRNA，就能达到超过90%的转染效率;对于难以转染的悬浮细胞系如K562或THP-1细胞，使用RNAFit转染终浓度为5 nM的siRNA，也可以观察到超过80%的转染效率。
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