中国药科大学徐晓军教授牵头在《Autophagy》发表了关于石蒜碱通过独立于自噬溶酶体途径SCAP，可以改善高热量饮食引起的肥胖、高血脂和胰岛素抗性的文章，IF>11。
该项研究中使用了汉恒生物质粒产品：pHBcas9/SCAP/gRNApuro
夏天到了，面对美味的冰激凌和它爆表的热量，你是不是在纠结呢？不吃对不起自己滴答哈喇子的嘴，吃又不想去单车房折磨自己的腿，难道就不能雪糕穿肠过，不留一滴油？
该项研究的成果对广大吃货可真是好消息，何出此言？我们一起看看就知道了！
1、调控脂质紊乱的关键症结
减少脂质合成可以作为治疗脂质紊乱引起的代谢综合征的辅助手段。一组被称为SREBF/SREBPs的转录因子是调节脂质生物合成的核心分子。SREBF/SREBPs以前体形式存在于内质网上并与SCAP和INSIG1形成复合体，在胆固醇降低时，与INSG1解离，并在SCAP的护送下进入高尔基体，被剪切后转运至核内启动数个脂质相关基因的表达。SCAP的角色很关键，不但运送SREBF/SREBPs,还维持其前体和成熟体的稳定。在SCAP缺陷的CHO细胞中，SREBFs的前体和成熟的核形态都消失了。如果没有SCAP, ER中的SREBFs是不稳定的，不能迁移到高尔基体，也就不能启动相关基因的表达。正因如此，SCAP成为代谢性疾病治疗的一个重要靶点。
迄今为止，已报道了一系列SCAP抑制剂，包括胆固醇、脂肪抑制素和甜菜碱等，这些化合物使SCAP-SREBFs复合物不再向高尔基体运动，从而抑制了SREBFs活性，减轻了肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗等代谢性疾病的症状。但他们同时会引起内质网的应激反应，持续的内质网应激可诱导心肌细胞凋亡、脂肪堆积、胰岛素抵抗和非酒精性脂肪性肝炎。氧甾醇还激活NR1H3/LXR，方面，NR1H3的激活诱导胆固醇逆向运输，从而在动物模型中抑制动脉粥样硬化的发展。另一方面，NR1H3激动剂也通过SREBF1 c增加脂肪生成，导致高甘油三酯血症和肝脂肪变性。因此，理想的SCAP抑制剂应该在不激活ER应激或NR1H3的情况下抑制SREBFs通路，以治疗动脉粥样硬化和2型糖尿病。
在这项研究中，科学家们就发现了一种叫做石蒜碱的小分子化合物，与其他分子抑制SCAP的机制不同，石蒜碱在转录后水平调控SCAP的表达量，一旦SCAP发生降解，SREBFs便被释放并进行泛素介导的蛋白降解。有趣的是，SCAP通过独立于自噬的途径被转移到溶酶体进行降解。IP-MS数据表明，这一过程是由SQSTM1介导的。与甾醇相比，石蒜碱既不诱导内质网应激反应，也不激活NR1H3。在高脂饮食(HFD)诱导的肥胖小鼠中，石蒜碱治疗降低了血清和组织中的脂质水平，增加了胰岛素敏感性。
2、另类的石蒜碱是如何发现的？
为了鉴别直接靶向SCAP的小分子，采用AlphaScreen-based cellular thermal shift assay (CETSA)体外高通量检测系统，对数百个小分子化合物进行了筛选，将胆固醇用作与SCAP相互作用的阳性对照。番茄碱，一种吲哚西定生物碱，被发现显著增加AlphaScreen信号。实验证实在温度和剂量依赖的情况下，石蒜碱增加了SCAP的热稳定性。通过一系列的软件模拟，发信石蒜碱是通过SCAP的(A1029和Y793)进行结合来实现其功能的。
石蒜碱以剂量依赖的方式显著抑制SREBFs活性(高达70%)，且不引起明显的细胞毒性。与甾醇使SREBFs前体显著积累不同，石蒜碱处理后SREBFs的前提和成熟体均降低了，胆固醇、脂肪酸和甘油三酯合成的相关基因在石蒜碱的处理下均显著下调了。与SCAP结合后，石蒜碱以时间和剂量依赖的方式显著降低SCAP蛋白水平，SCAP降低后，SREBFs被释放，并被多聚泛素化后降解。而在敲除SCAP的细胞系中，石蒜碱不能降低SREBFs的前体水平，蛋白酶体抑制剂MG-132可以逆转SREBF1的降解，说明这种降解过程取决于蛋白酶体途径。
Ps:作者使用汉恒生物提供的pHBcas9/SCAP/gRNApuro质粒来构建SCAP KO细胞系
3、石蒜碱降低了SCAP蛋白水平
石蒜碱以时间和剂量依赖的方式降低SCAP蛋白而不改变SCAP的mRNA水平，作者推测石蒜碱可能在转录后水平影响SCAP。在蛋白合成抑制剂环己酰亚胺的作用下，SCAP蛋白的降解速度加快，表明石蒜碱促进了SCAP的降解。而当细胞被MG-132、AEBSF或蛋白酶抑制剂处理时，石蒜碱诱导的SCAP降解却并没有逆转，这表明石蒜碱诱导SCAP的降解不依赖于泛素-蛋白酶体途径。除了泛素-蛋白酶体途径外，细胞蛋白也可以通过自噬-溶酶体途径降解。为了验证番茄红素是否通过这一途径促进了SCAP降解，科学家首先使用一系列抑制自噬相关基因(ATGs)的抑制剂和siRNAs抑制自噬。通过3-MA处理抑制自噬体的形成，不能逆转石蒜碱诱导的SCAP降解。此外，当分别或同时在肝细胞中抑制ATG5，ATG5和ATG7时，石蒜碱诱导的SCAP降解没有逆转。科学家又使用一系列溶酶体酸化和溶酶体酶活性抑制剂来破坏溶酶体活性，此时石蒜碱诱导的SCAP降解基本上被消除。石蒜碱对肝脏自噬的影响研究发现，石蒜碱处理不影响自噬通量。研究石蒜碱处理后SCAP在细胞中的定位发现，与未处理相比有更多的SCAP被转运到溶酶体，而且在自噬缺陷的细胞中，溶酶体的活性不受影响，石蒜碱处理后大量SCAP依然被运送到溶酶体。这表明石蒜碱通过自噬不依赖的溶酶体途径促进SCAP的降解。对其他形式的囊泡转运护送蛋白质到溶酶体降解的途径研究发现，伴侣蛋白介导的自噬(CMA)，内体微自噬(eMI)，内质网-溶酶体相关降解(ERLAD)，以及转运所需的内体分选复合体(ESCRT)均不参与石蒜碱诱导的SCAP降解。
4、石蒜碱是怎么将SCAP转运到溶酶体将其降解的呢？
科学家在HL-7702细胞中免疫沉淀含有scap的复合体，并通过串联质谱分析比较了其结合蛋白的变化。在石蒜碱处理和阴性对照间，共鉴定出164个不同表达的蛋白，其中66个蛋白与SCAP的结合增强(红点)，98个蛋白与SCAP的结合减弱(绿点)。在这些结合候选基因中，SQSTM1 (sequestosome 1)和SCAP的结合上调幅度最大，达到2.88倍。基于ipi - ms和之前的数据，我们推测在经过石蒜碱处理的肝细胞中，SQSTM1可能直接将SCAP装载到溶酶体中，而不是通过自噬体。western blot结果证实，石蒜碱处理显著促进了外源SCAP与SQSTM1的互作，减少了SCAP与INSIG1的互作。
为了进一步研究SCAP和SQSTM1之间的特定结合区域，我们先将HA标记SCAP的不同截短片段与flag标记的SQSTM1全长共同过表达，发现SCAP的736-1276氨基酸(WD40域)区域为与SQSTM1相互作用区域。放过来，我们将HA标记SQSTM1的不同截短片段与myc标记的SCAP全长共同过表达。发现SQSTM1的170-260氨基酸(TB)区域为与SCAP相互作用区域。
脂抑素预处理显著增加了SCAP- insig1的结合，干扰了SCAP- sqstm1的相互作用，从而阻断了SCAP向溶酶体的转位，并显著降低了石蒜碱诱导的SCAP降解。这些数据表明将SCAP转运到溶酶体发生在 SCAP脱离ER后。石蒜碱处理后，SCAP、SQSTM1和SEC24D的共定位增加。通过fatostatin预处理阻断SCAP出口，完全阻断了SCAP与SEC24D和SQSTM1的，小干扰RNA沉默SQSTM1几乎完全阻断了石蒜碱向溶酶体转运SCAP。因此，番茄碱诱导的SCAP降解也被逆转。同样，在sqstm1 - /-MEF细胞中，番茄碱不再导致SCAP降解，以及SCAP溶酶体转运。当全长SQSTM1被补充回SQSTM1 - /-MEF细胞时，由于SCAP被运输回溶酶体，重建了由石蒜碱诱导的SCAP蛋白降解。这些数据表明，SQSTM1和SCAP的结合是SCAP溶酶体运输和降解所必需的。因此，我们将这种新的降解途径称为sqstm1介导的自噬独立溶酶体降解(SMAILD)途径。
5、体内实验：石蒜碱让小白鼠瘦身
随后又在小鼠体内进行了验证，发现高热量+石蒜碱饲喂的小鼠与对照相比体重明显减轻，脂肪体重比也明显下降，这表明石蒜碱可以改善饮食引起的小鼠肥胖。实验组的小鼠血液和肝脏中的TC,TG明显低于对照，石蒜碱还降低了白色脂肪组织(WAT)的重量和棕色脂肪组织(BAT)的细胞大小。实验组小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素耐量明显改善，此外，石蒜碱还能降低空腹血糖和胰岛素的升高。
接下来，我们研究了经石蒜碱处理对高热量饮食诱导的肥胖小鼠肝脏中SCAP、SREBFs及其靶基因表达的调节。在小鼠肝脏中，与脂肪分解，脂肪酸氧化相关的基因不受石蒜碱影响。这些结果表明，石蒜碱治疗减轻脂肪积累和代谢综合征，可能不是通过增加脂肪分解和脂肪酸氧化。综上所述，我们的结果表明，石蒜碱改善了脂质代谢，而不诱导内质网应激，并激活NR1H3，这可能有助于降低脂质积累和增强胰岛素敏感性。
真可谓是一个大块人心的消息，既可以降低脂肪积累，还没有毒性作用，说不定哪天石蒜碱真的可以使我们“狂吃不胖”！不过要保持fit，享用完美食还是要保持一定运动，燃烧掉多余的卡路里~
原文标题：Discoveryof a potent SCAP degrader that ameliorates HFD-induced obesity,hyperlipidemiaand insulin resistance via an autophagy- independent lysosomal pathway
- 浏览 3918 次
