诺贝尔化学奖颁给它?一文看懂Crispr/Cas9技术的比较优势

2020 年诺贝尔化学奖重磅公布,这项大奖颁给了法国微生物学家Emmanuelle Charpentier和美国生物学家Jennifer Anne Doudna,以表彰她们开发了一种基因组编辑方法——Crispr/Cas9。

 

在过去的十几年里,RNAi技术一直都是功能基因筛选的经典技术。但2012年Crispr/Cas9基因编辑技术问世以来,经过短短几年的发展,已经逐渐取代RNAi技术,成为当下最炙手可热的研究工具[1]。下面,小恒将带领大家一起来回顾一下这两种技术,并分析一下它们的优缺点。

 

 

Crispr/Cas9

 

Crispr/Cas9最早发现存在于许多原核生物的基因组中,用来抵御外源遗传物质入侵,比如噬菌体病毒和外源质粒。同时,它为细菌提供了“获得性免疫”,当噬菌体病毒入侵时,细菌就会产生“记忆”,防止携带同样遗传物质的病毒再次入侵。

 

这个系统的原理是crRNA(crispr-derived RNA)通过碱基互补配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成复合物,该复合物会引导cas9核酸酶识别并靶向结合到crRNA配对的双链DNA上并切割DNA,从而实现对基因组DNA的编辑[2]。而通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA,改造成具有引导作用的sgRNA (single guide RNA ),从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割(图1)。

 

 

图1:工程化的CRISPR/Cas系统。该系统是个二元系统:负责切割的Cas9核酸酶和定位用的guide RNA (sgRNA)

 

 

 

RNAi

 

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指小分子双链RNA可以特异性地降解或抑制同源mRNA表达,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。

 

这项技术的原理是双链RNA分子在Dicer酶的作用下可产生一系列长度为21~22个nt的siRNA,siRNA 双链结合一个核酶复合物形成RNA 诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。激活的RISC 通过碱基配对定位到同源mRNA 转录本上,并在结合部位切割mRNA,被切割后的mRNA随后降解[3](图2)。

 

 

 

RNAi技术和Crispr/Cas9技术优缺点比较

 

1)从抑制基因表达的效率上来讲,RNAi是在转录后水平降低基因表达,而Crispr/Cas9则可以靶向DNA并永久改变或敲除基因表达。有些时候可能需要Crispr/Cas9来完全敲除,以免残留的低水平蛋白表达造成任何不确定的影响。例如在癌细胞中,某些基因有多个转录本的情况下,这种完全敲除就很有效。当然,在某些情况下敲低可能是更好的选择。例如,某些基因是细胞生长所必需的,完全敲除会造成细胞致死,导致基因功能难以研究,相比之下敲低则可以更好地模拟药物对靶点的抑制。

 

2)从脱靶效应上来讲,RNAi和Crispr/Cas9都有脱靶效应的风险。因为shRNA或sgRNA均可靶向带有互补种子区的序列,造成依赖序列的脱靶效应。此外,RNA还表现出不依赖序列的脱靶活性。两者相比,由于CRISPR系统必须在转录起始位点附近才能发挥作用,其脱靶效率要远低于RNAi。

 

3)从操作的难易程度上来讲,Crispr/Cas9需要将Cas9和sgRNA一起导入细胞,而RNAi则不需要另外的蛋白因子,转染相对比较快速简单,能够迅速引起表型变化。不过随着技术的快速发展,递送载体和sgRNA设计的改进,相信未来Crispr/Cas9技术会得到更广泛地应用。

 

 

通过分析两者的优缺点,小恒总结出Crispr/Cas9有以下特点和优势:

 

  • 靶向精确性更高。sgRNA靶向序列必须和基因组序列完全匹配,Cas9才会对DNA进行剪切。

  • 可靶向DNA并且完全敲除基因的表达。

  • 无物种限制。

  • 可以实现对多个靶点同时敲除。

 

 

Referencee

[1] Cong, L.; Ran, F.A.; Cox, D.; Lin, S.; Barretto, R.; Habib, N.; Hsu, P.D.; Wu, X.; Jiang, W.; Marraffifini, L.A.; et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013, 339, 819–823.

[2] Garneau, J.E.; Dupuis, M.E.; Villion, M.; Romero, D.A.; Barrangou, R.; Boyaval, P.; Fremaux, C.; Horvath, P.;

Magadán, A.H.; Moineau, S. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid  DNA. Nature 2010, 468, 67–71

[3] Wilson, R.C.; Doudna, J.A. Molecular mechanisms of RNA interference. Annu. Rev. Biophys. 2013, 42, 217–239.

 

 

 

目前汉恒提供的Crispr/Cas9服务有:

 

【单克隆敲除细胞株】和【gRNA载体现货】

 

 

 

 

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