siRNA和shRNA简介
siRNA简介
小或短干扰RNA（small/short interfering RNA, siRNA）是一类20-25个核苷酸长度的双链RNA分子；
依赖于RNA聚合酶Ⅲ启动子（pol Ⅲ），操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。pol Ⅲ可以在细胞中表达多个小分子RNA,，通过3-6个U来终止转录。
shRNA简介
小发卡或短发卡RNA（a small hairpin RNA or short hairpin RNA, shRNA）是一段具有紧密发卡环（tight hairpin turn）的RNA序列；
shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上（RNA-induced silencing complex，RISC），该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。
主要因素
发挥作用的部位01
研究表明，siRNA主要聚集在细胞质，而shRNA主要在细胞核中，理论上shRNA较siRNA干扰效果更好；干扰效率也可能与目的基因分布的位置有关。但是关于siRNA和shRNA干扰效率不同的研究报道较少，尚不清楚其机制。
案例1
1）如图，小鼠体内实验将pGL3分别和siRNA、shRNA（siLUC2和pShagLUC序列相同）混合后，尾静脉注射小鼠体内，通过生物素活性检测发现，3h内shRNA和siRNA干扰效率差距不明显，但6h，检测shRNA干扰效率较siRNA效果好。
2）分析3h内干扰效率无差距主要是siRNA转移细胞质和shRNA转移至细胞核同时发生。
细胞类型以及细胞不同的胚胎发展阶段02
案例1
研究表明，在小鼠体内用cre系统引导A1基因敲除，结果显示胸腺细胞中的RNAi干扰效率明显比淋巴细胞中的干扰效率高：
1）图左表明，A1基因在小鼠体内胸腺细胞和淋巴细胞中mRNA表达水平正常化。
2）图右表明，较野生型mRNA表达量，敲减后，胸腺细胞中A1 mRNA仅剩16%，显著低于淋巴细胞细胞。
3）并且淋巴细胞中，淋巴T细胞干扰效率较淋巴B细胞好。
案例2
研究表明，在成熟T细胞中，RNAi干扰效果普遍较其它细胞低，主要是成熟淋巴细胞经历RNAi后，其细胞能力受损（不影响细胞形态和增殖能力），无法发挥干扰作用。
如图，在成熟T细胞和NIH3T3纤维细胞中分别敲减不同的基因（A1，itch，Nedd），干扰效率差距明显。
细胞内siRNA/mRNA表达水平比例
03
案例1
研究表明，提高mRNA表达水平，干扰效率未提高，主要受siRNA/mRNA表达水平比例限制：
如图，提高胸腺细胞中A1 mRNA表达水平约6倍，NB检测siA1干扰效率未增加，说明每个siRNA所干扰的mRNA达到饱和，所以增加mRNA表达量，干扰效率很难增加，此时增加siRNA表达量可能是提高干扰效率的唯一途径。
案例2
研究表明，在不同细胞中，即使细胞内siRNA/mRNA表达水平比例一致，干扰效率也显著不同。
如图，巨噬细胞BMDM和淋巴细胞中siRNA/mRNA表达水平比例一致时，巨噬细胞中的干扰效率显著高于淋巴细胞。
RNAi信号通路蛋白的表达水平
04
参与干扰信号通路的基因包括，RNA诱导沉默复合物家族蛋白（ago1-ago4），dicer，exportin-5 (XPO5)，RNA结合衰减蛋白（TRAP）
案例1
ago2能够介导RNA被剪切来实现RNA降解，导致翻译受阻，可作为RNAi发挥作用的催化引擎。并且研究数据表明提高ago2表达水平能够增强干扰效率：
1）如图，将EGFP shRNA和干扰信号通路基因（ago2、dicer、XPO5）分别共同转入HEK293细胞中，增加ago2基因表达水平显著提高shRNA的干扰效率，而其它RNAi信号通路蛋白，随着表达水平的增加对RNAi干扰效率无作用。
2）并且ago2/shRNA表达水平比例越高，干扰效率越好
案例2
RNase Ⅲ dicer是dsRNA剪切成siRNA过程中不可或缺的酶。研究数据表明提高dicer表达量，能够增强干扰效率：
如图，通过双荧光素酶实验，将dicer表达质粒载体或对照载体和shRNA共同转入hela细胞中，检测荧光素酶活性，结果表明提高dicer表达量，荧光素酶活性显著下降，即干扰效率增强。
shRNA序列设计
05
案例1
shRNA序列长度影响干扰效率：
如图，设计不同长度的EGFP shRNA，在HEK293细胞中检测到，碱基序列为19-21bp时的干扰效率较18bp和22bp时更好。
案例2
loop环大小为6nt或9nt时，并且shRNA结构为正义链-loop环-反义链时的干扰效率最好。
如图，研究数据表明，loop环大小为6nt或9nt时较4nt的干扰效率明显好，并且shRNA结构为sense-loop-antisense时，干扰效果更好。
案例3
loop环碱基序列影响基因干扰效率：
如图，研究表明将目的基因序列克隆在荧光素酶报告基因载体的3’UTR端，分别与不同的shRNA载体共同转染HEK293细胞中，通过分析荧光素酶活性发现，5-nt loop环上额外的2个碱基对RNAi干扰效率不可或缺。
案例4
loop环碱基序列影响基因干扰效率：
研究表明，通过将常用的shRNA间隔序列TTCAAGAGA 替换成 ATCAAGAGA序列后，shRNA干扰效果显著增强。
总结-（提高干扰效率的方法）06
1. 避免用淋巴细胞做干扰实验；
2.提高RNAi/mRNA表达水平比例，提高干扰效率，主要途径是提高siRNA或shRNA表达水平；
3.提高ago2或dicer基因表达水平，提高干扰效率；
4. loop环序列可换成 ATCAAGAGA；
5. 设计shRNA碱基序列为19-21bp。
参考文献：
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[4]Kazunari Taira.Overexpression of Dicer enhances RNAi-mediated gene silencing by short-hairpin RNAs (shRNAs) in human cells[J].Nucleic Acids Symposium Series,2004
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End
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