随着生物科学技术的发展，进行离体细胞和在体的功能验证已成为高分文章的必要组成部分，在进行一系列的验证实验时常用到一些表达工具，今天就来聊聊这其中的两种病毒工具：腺相关病毒(AVV)和慢病毒（LV）。
AAV源于非致病的野生型腺相关病毒，具有安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低、在体内能长时间表达外源基因等特点，是进行体内验证的首选。慢病毒载体（LV）主要用于体外转基因研究。LV具有可感染分裂和非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点。
利用LV进行细胞中的基因功能验证，用AAV在动物体内进行功能验证，两者功能相互印证，我们便可以继续往下开展详尽的机制研究。下面我们以一篇文章为例，来看看如何应用LV和AAV做一篇高分文章。
文章名：TRIB3 Interacts with Beta-catenin and TCF4 to Increase Stem Cell Features of Colorectal Cancer Stem Cells and Tumorigenesis.
IF:20.773
作者：胡卓伟（北京协和医院）
病毒工具：LV，AAV
简要背景：Wnt信号β-actin蛋白的激活有助于结直肠癌的发生。tribbles pseudokinase 3 (TRIB3)的表达在一些结直肠肿瘤中升高，并与不良预后相关。作者对TRIB3是否通过与Wnt信号通路相互作用促进CRC细胞的干细胞特性和肿瘤发展进行了研究。
方法：在C57BL/6J-Apc Min /J小鼠体内注射( Apc Min /J-Trib3 KD )AAV和对照（Apc Min /J-Ctrl）AAV，在BALB/c体内利用AAV过表达TRIB3，利用AAV-shRNA敲低β-catenin蛋白。对这些小鼠用氮氧甲烷和右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导大肠杆菌相关癌症，并收集肠组织，通过组织学、基因表达谱、免疫组织化学和免疫荧光分析。利用LV分别对LGR5阳性和LGR5阴性HCT-8细胞、CRC细胞进行TRIB3敲低或过表达并进行成球分析。双荧光素酶报告、染色质降水、免疫荧光和免疫印迹分析分析TRIB3与Wnt信号β-catenin的关系，并测试肽P2-T3-A6的抑制剂作用。
主要结果：C57BL/6J-Apc Min /J小鼠注射AAV 1周后，TRIB3敲低组的结肠中检测到TRIB3表达的降低，6周后对照组的结直肠中形成肿瘤而敲低组中未见肿瘤形成，且敲低组的存活率高于对照。但最后结直肠肿瘤的发生率没有差异，表明敲低TRIB3延缓了结直肠癌的发生。敲低组中，Wnt信号通路中β-catenin调控的基因表达更低，对照组中，肿瘤内TRIB3和β-catenin的表达较癌旁组织高，且发现两者在肿瘤中共定位。Trib3过表达的BALB/c小鼠肿瘤比对照更重，敲低actin后不但减轻了肿瘤，而且恢复了由过表达TRIB3引起的变化，表明β-catenin对Trib3的促肿瘤作用至关重要。
图1.C57BL/6J-Apc Min /J体内AAV过表达TRIB3促进结直肠癌发展，干扰β-actin一直结直肠癌发展。
利用LRG5对HCT-8细胞进行流式分选，发现LRG5阳性细胞TRIB3表达高于LRG5阴性细胞，LRG5阴性细胞中过表达TRIB33可以增加直肠癌干细胞（CCSC）标记基因的表达，LRG5阳性细胞中敲低TRIB3则降低了CCSC标记基因表达。肿瘤源性球状体的形成代表着CSCs或具有干细胞相关特征的细胞的富集，利用C57BL/6J-Apc Min /J小鼠分离的CRCs通过感染不同LV建立肿瘤来源的球形培养体系，发现TRIB3过表达促进肿瘤球形成和传代，TRIB3缺失抑制这一过程，TRIB3过表达并缺失β-catenin限制了这种效果，表明TRIB3通过β-catenin发挥这些促进作用。用相应LV感染HCT-8后得到了相同的结果。这表明TRIB3增强了直肠癌细胞的干性特征。
图2.LV体外过表达TRIB3增强CRC细胞干性，干扰TRIB3或β-actin抑制CRC细胞干性
Co-ip和GSTpull-down证明TRIB3和β-actin互作，并通过TRIB3与TCF4的相互作用使三者形成复合体，TRIB3通过使β-catenin蛋白和TCF4接近从而稳定β-catenin- TCF4复合物并增强其转录活性，从而增强Wnt信号中β-catenin调控蛋白的表达活性。
TRIB3过表达的小鼠中敲低β-catenin后TRIB3表达下调，Wnt刺激后的CRC细胞中TRIB3表达上调，表明β-catenin可能对TRIB3起积极的反馈调节作用。双荧光素酶表明β-catenin和TRIB3启动子区域作用，CHIP实验证明TCF4与TRIP3启动子区域结合，表明TRIP3是β-catenin-TCF4转录调控的靶点。
计算机预测到多肽T3A6与TRIB3有良好亲和力，将细胞穿透肽P2与T3A6融合成P2-T3A6，融合多肽与TRIB3亲和力增强，P2-T3A6扰乱TRIB3与β-catenin和β-catenin与TCF4的相互作并降低TRIB3在CRC和HCT-8细胞中的表达。P2-T3A6通过加速降解和抑制转录的方式下调TRIB3的表达，可以通过抑制TRIB3与β-catenin互作抵消crc细胞的干性。
体内实验和HCT-8细胞实验表明，P2-T3A6并不干扰β-catenin与其他互作蛋白的作用，P2-T3A6处理8周大的小鼠，与对照相比，肿瘤结节减少，小鼠存活率升高，且未对正常小鼠的心、肺、肝、肾、脾、结肠组织造成明显的组织病理学改变，也未影响正常小肠细胞的增殖或诱导细胞凋亡。这表明P2-T3A6是一种很有前景的CRC治疗先导化合物。
图3.多肽P2-T3A6可有效抑制结直肠癌发展
本研究中科学家用到了由汉恒生物（HANBIO）提供的针对TRIB3和β-catenin过表达和干扰的AAV和LV，为了方便广大科研工作者的研究，助力高分文章发表，我们特别推出了过表达慢病毒和腺相关病毒套餐活动。
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