lentiCRISPR v2载体是张锋实验室发布的一个慢病毒载体，cas9和sgRNA表达框在同一个载体上，而且Cas9的C端带有FLAG融合标签，载体包含Puromycin抗性基因，适合建系。验证sgRNA活性的时候也适合瞬转；包装成慢病毒适合常规细胞系的建系，构建非常方便。
LentiCRISPR v2应用指南
网址：https://www.addgene.org/52961/
克隆gRNA使用BsmBI位点，载体可以切出一个~1.9 kb的filler片段，便于confirm酶切成功并利于载体回收；
BsmBI的位点是 
，酶切之后不需要CIP脱磷也不会自连！
Cas9的C端带有FLAG tag,可以WB或者Immunostaining
EF1-a promoter被优化的小而强，极大提高了慢病毒包装的效率
载体带有Puromycin抗性，可以富集转染/感染成功的细胞。
如何设计gRNA
gRNA设计方法和原则请参考上第一步“lentiCRISPR v2应用指南”，链接如下： https://www.addgene.org/52961/
对于lentiCRISPR v2克隆，其合成的oligo末端和pX330不同，请注意设计；
举个例子说明（克隆小白千万注意oligo的方向）
如何克隆载体
Backbone的酶切体系同上方步骤“ 如何设计gRNA“（说明：不脱磷处理参考黑框，脱磷参考红框内操作）
Oligo的退火条件也参考上方步骤（说明：如果载体不脱磷，oligo不需要磷酸化；载体脱磷参考红框内操作，oligo就需要加磷处理！！！（红色框内是FengZhang提供的protocol，设计脱磷，仅作为参考）
仅作参考
病毒包装体系
包装病毒使用的包装体系如下（for 100 mm dish，6x106 293T）
转染条件：用汉恒生物的细胞转染试剂 LipoFiterTM
收集48hr和72hr病毒上清，待用。
病毒包装的protocol非常多，小编只列了基本的信息。后续会出详细写慢病毒包装步骤的干货！
目的细胞系的感染/转染
转染 （2 μg plasmid/60 mm dish，细胞密度60-80%）
【v2=lentiCRISPR v2，下同】
感染 （1-5 ml病毒上清）【v2=lentiCRISPR v2，下同】
PCR测序产生的套峰示意图
KO单克隆的获取
单克隆的挑取---单克隆可以有限稀释到96-well plate（～30 cells/plate）（293T、HeLa、MEF等细胞系推荐使用）。如果编辑效率50%，推荐分两块plate即可，最终拿到20-30个单克隆一般可以得到成功KO的细胞系；或者铺到100 mm dish里，一周后挑取单克隆（这种方法适合单细胞不容易成活的细胞系如，但是挑取的单克隆偶尔不纯，有时需要重新亚克隆）。
单克隆的鉴定---根据设计，推荐使用酶切鉴定的方法（见设计部分），通量高；如果抗体比较好用，推荐使用WB检测蛋白，这种方法最彻底；最末一种方法就是直接测序鉴定，该种方法费时费力费钱，建议设计时尽量避开。
有限稀释法（悬浮细胞适用此法）---50-100 cells 均匀分到96-well plate
单克隆挑取法
KO单克隆的鉴定
直接测序或者酶切鉴定
抽取genomic DNA，然后PCR测序或者或者酶切鉴定
测序
酶切鉴定
WB鉴定
如果抗体好用，直接用dot blot或者免疫荧光染色可以，速度快，通量高。当然普通WB也可以。
汉恒生物拥有丰富敲除细胞系构建经验，可以实现彻底敲除目的基因的目标
我们的优势：
·种子优良--严选低代数细胞来源，无支原体无黑胶虫
汉恒生物所有的细胞均从中科院细胞库购买，代数低无污染，还可以提供STR检测报告。
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汉恒生物采用慢病毒系统转染目的细胞，提高感染效率，更高效快速的挑选KO细胞。
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汉恒生物所有的敲除单克隆都通过构建T载体进行测序验证，清晰看出DNA序列的具体变化，确保敲除性状稳定不恢复。
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