干扰腺病毒

一、目的基因干扰序列的合成及穿梭质粒构建
 

1、siRNA序列合成

（1）客户提供干扰序列；

（2）针对目的基因汉恒代为设计并合成三对特异性的siRNA序列，根据siRNA序列设计对应茎环结构的shRNA序列，然后合成三对shRNA序列（结果中保证其中一条干扰效率不低于70%）。
 

2、穿梭质粒的构建

将三对 siRNA分别克隆入腺病毒载体，构建shRNA干扰腺病毒载体，并进行测序鉴定构建成功。

汉恒生物多年来构建了用于各种用途的干扰腺病毒载体（HanBioTM）。

二、干扰腺病毒载体的包装和浓缩

1、腺病毒骨架质粒的构建与病毒包装

大量扩增三种干扰穿梭质粒和腺病毒骨架质粒，并将腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒同时转染入293A细胞进行重组和腺病毒初步包装。
 

2、腺病毒的大量扩增和浓缩

待包装细胞出现腺病毒感染特异性细胞病变（CPE，约15天），挑取细胞病变斑块，转入新鲜293A细胞中进行病毒少量扩增。至细胞再次出现CPE，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1代病毒。以P1代腺病毒感染293A细胞，连续进行三代感染，至P4代大量扩增效率最高的干扰腺病毒，待CPE后收集病毒并对病毒进行体外大比例浓缩，得到有效滴度为10^10PFU/ml的带有目的基因的腺病毒颗粒。
 

注：动物实验的腺病毒为什么需要纯化？

如果是细胞实验，只需要将腺病毒进行浓缩即可（基因过表达腺病毒载体的包装和浓缩第三步）；如用于体内操作，必须纯化病毒，因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的fiber和penton蛋白（细胞毒素）、介质、血清以及细胞碎片。如果病毒被注入动物体内，这些成分会引起强烈的免疫反应。

客户提供： 可以提供干扰序列也可不提供干扰序列。

汉恒生物提供： 三种干扰腺病毒，也可进行效率鉴定以筛选干扰效率最高的腺病毒（需要客户提供相关蛋白的抗体），提供非纯化10^10滴度的干扰腺病毒和对照慢病毒，均为1ml（纯化滴度可以达到10^11）。