支原体检测试剂盒

 

 

产品简介：   

 

 支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。支原体的侵染会引起细胞功能和基因表达的严重改变，并造成持续危害。由于支原体污染会严重影响实验结果的可靠性、重复性和一致性，对支原体的常规检测非常重要。
     

针对细胞、培养基以及动物血清的支原体检测，我们推出了Myco-PCR-TEST 快速支原体检测试剂盒。本试剂盒基于PCR检测原理，根据支原体高度保守的16和23SrRNA区域设计的特异性引物，经过简单快速的PCR，从而迅速准确判断支原体污染是否被清除。

 

 汉恒生物（www.hanbio.net）推出的SaveIt^TM 抗支原体试剂能够在不影响细胞状态的前提下能够有效的清除支原体污染，从而使一些珍贵的细胞受到支原体污染之后能够得到挽救。

 

使用说明：

 

使用Trizol 法抽提待检测细胞的RNA，反转录为CDNA 后，加入支原体检测引物，进行PCR 检测细胞支原体污染情况。

 

操作步骤：

 

1、样品处理

 

⑴ A：培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按1ml/10cm²比例加入。

     B：悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×10⁶动物、植物或酵母细胞，或10⁷细菌细胞。

⑵ 细胞加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。

⑶ 12,000rpm 离心5min，弃沉淀。

⑷ 按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。

注： 禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。

⑸ 4℃ 12,000g离心15min。

⑹ 吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。

⑺ 按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。

⑻ 4℃ 12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

⑼ 按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

⑽ 4℃ 8,000g离心5min，尽量弃上清。

⑾ 室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否侧很难溶解。

⑿ 可用50ul H₂O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。注：H₂O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。

⒀ 测O.D值定量RNA浓度。注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间；

 

注：产率估计：培养细胞（ug RNA/10⁶ Cell）：5-15ug。细胞量过少，可酌 情减少Trizol用量；细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染；

 

 

2、反转录

 

请参照相关试剂盒说明书，如TaKaRa反转录试剂盒以及GIBICOL反转录试剂盒等。（见附录）

 

 

3、样品检测

 

预热水浴锅至96℃，将装有样品的1.5mL离心管水浴15min；在超净台中进行引物的混合稀释，配制PCR体系。

 

 

 

 

4、结果分析

 

分别利用表2的反应体系，表3的PCR反应条件进行扩增检测，跑胶结果如下（目的片段的大小：502-520bp）。

 

 

 

 

注：如果在502-520bp之间有条带为阳性，没有条带为阴性；阳性：支原体感染；阴性：  未感染；根据跑胶结果，样品1、2、3无支原体污染条带，样品未被支原体污染。

 

 

5、使用频率

 

 

 

 

6、注意事项

 

       ⑴ 请按照实验室规定，做好必要的防护措施，穿戴整齐。
　    ⑵ 操作过程中，注意避免交谈，以及佩戴好口罩；RNA提取以及反转录过程中，注意避免RNA污染以及降解等。
　    ⑶ 样品建议进行3次独立重复实验，以确认实验结果。
　    ⑷ 实验时，试剂盒组分中的试剂使用前应充分融化并混匀（混匀时禁止激烈振荡，只需要进行上下倒置多次进行混匀）。
　    ⑸ 细胞培养物中含有青霉素和链霉素等抗生物素不会影响本品的检测结果。