细胞凋亡检测

 

简介

       

      细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。

 

      细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

 

 

 

汉恒为您提供如下细胞凋亡检测服务

 

 

一、流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI 双染色法

 

基本原理

       

       细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca⁺依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。

 

实验步骤

(1) 用 PBS 洗细胞培养板两次，然后用胰酶消化，1000 rpm 离心 5 min，弃去培养液

(2) 各管加入 10 mL PBS，轻柔地悬浮细胞，洗细胞两次

(3) 计数1x10⁵细胞放入100ul  1X Binding Buffer，放入1.5ml EP管

(4) ANNEXIN V 5ul先孵育20min，再加入PI 3ul 再孵10min，室温避光

(5) 加入400ul Binding Buffer,流式细胞仪分析细胞凋亡情况

 

 

 

 

二、TUNEL

 

基本原理：

 

      TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

 

操作流程图：

 

实验步骤

1）、清洗：移去完全培养基，用 PBS 清洗一次细胞。 

2）、固定：用 4％的多聚甲醛在室温固定 15 分钟。 

3）、清洗：用 PBS 在室温漂洗三次，每次 10 分钟。 

4）、破膜：用含 0.1%Triton-X-100 的 PBS 在室温通透化处理 15 分钟。 

5）、清洗：用 PBS 在室温漂洗三次，每次 10 分钟。 

6）、封闭：用含 5%山羊血清（BSA）的 PBS 在室温封闭 1 小时。 

7）、清洗：TBST室温漂洗三次，每次10分钟。

8）、TUNEL溶液配制：Enzyme Solution和Label Solution以1：10混匀，避光备用，注意试剂用量，试剂盒价格昂贵，避免浪费。

9）、标记：用上诉配好的溶液，约20ul每张玻片，室温避光孵育10分钟，

10）、清洗：用PBS在室温漂洗三次，每次 10 分钟。 

11）、DAPI染核：加入 DAPI 染色液 1：2000 室温孵育 5 分钟。 

12）、清洗：用PBS 在室温漂洗三次，每次 10 分钟。 

13）、封片：用封片剂封片，在荧光显微镜下观察结果，免疫荧光照片用蔡司共聚焦显微镜。

14）、TUNEL positive dot 计算方法：DAPI和TUNEL positive dot 通过image pro软件，计算DAPI的阳性点作为细胞总数，TUNEL阳性点作为tunel点，最后计算 TUNEL/DAPI×100%作为凋亡细胞的比率。

实验实例