双萤(荧)光素酶检测试剂盒

 

双萤光素酶检测试剂盒

 

萤光素酶（Luciferase） ：是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Firefly)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶，荧光素酶可以催化特定的荧光素底物转变成氧萤光素，同时发出强烈的光。

 

萤火虫萤光素酶（firefly Luciferase，F-Luc）， 61kDa，可催化D-荧光素发出萤光

海肾萤光素酶（Ranilla luciferase，R-Luc）， 36kDa，可催化腔肠素发出萤光

 

 

 

 

特点

1.底物存在时，催化底物发出萤光

2.萤光亮度和萤光素酶的量成正比

 

 

应用

 

miRNA和靶基因结合双萤光素酶验证方案

 

miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过靶向结合目的基因的结合位点（通常位于基因的3端非编码区——3UTR区），抑制其上游基因的表达。

鉴于miRNA的特点及luc的特性。

 

miRNA及其靶结合位点的验证可以通过双荧光实验来实现，包括：

●　miRNA与其靶点相关分析

●　miRNA靶基因验证

●　lncRNA与circRNA 吸附miRNA验证等

 

 

 

检测原理

 

把miR潜在结合构建到报告载体上F-Luciferase下游，将报告载体与 miR的mimics共同转染到细胞内测定荧光素酶值，分析F-Luciferase活性即可反应miRNA与结合位点的结合特性

 

 

检测方法及载体工具

 

把miR潜在结合位点上下游~500bp（he/或突变位点）构建到荧光素酶报告载体上psiCHECK2的F-Luciferase下游3UTR区，载体上持续性表达R-Luciferase元件作为内参， 与miR的mimics（小片段双链miRNA ）/ NC共同转染293T细胞共同转染到细胞内测定荧光素酶值，分析F-Luciferase活性即可反应miRNA与结合位点的结合特性

 

miRNA及靶点验证F-Luciferase报告载体

 

 

产品规格

 

 

 

实验步骤

 

一、细胞转染

 转染48 h后收集样检测。

 

二、荧光检测

1.      将培养箱中的24孔板取出，放在室温，至细胞平衡到室温。

2.      加入细胞裂解液Lysis Buffer，充分裂解后12000rpm 4℃离心10min并转移至96孔板中。

3.      每孔加入F-Luc底物试剂，放入酶标仪中测定记录Firefly luciferase值。

4.      每个孔中加入Stop solution终止F-Luc反应并淬灭F-Luc荧光

5.      每孔加入R-Luc底物放入酶标仪中测定记录Renillaluc luciferase值

6.      计算Firefly luciferase相对荧光值F-Luc/ R-Luc