双荧光素酶检测试剂盒

 

 

产品包装和保存条件

 

 

 

试剂盒于-20℃保存。Lysis Buffer -20℃可保存一年。反应试剂（Luciferase Reaction Reagent和Luciferase Reaction Reagent II）加入底物后，分装、避光保存；-70℃可保存一年，-20℃可保存一个月；避免反复冻融。试剂使用前需平衡至室温。

 

 

实验原理

 

  萤火虫萤光素酶（firefly luciferase, fluc）和海肾萤光素酶（renilla luciferase, rluc）可分别催化萤光素（luciferin）和腔肠素（coelenterazine）产生生物萤光反应，反应过程如下图所示。

 

 

 

 

在双萤光素酶反应中，首先用Luciferase Reaction Reagent检测fLuc信号；随后，直接加入Luciferase Reaction Reagent II，将fLuc的信号猝灭，同时产生rLuc信号。该方法具有操作简单、检测快捷、灵敏度高等优点。

 

 

实验步骤

 

1.配制试剂

 

（1）Lysis Buffer：

Lysis Buffer (5X) 用水稀释5倍，配制成工作液；

 

（2）Luciferase Reaction Reagent：

用Luciferase Reaction Buffer（10 ml）溶解Luciferase Reaction Substrate干粉（短暂离心再开盖），混匀后分装、避光保存，避免反复冻融；

 

（3）Luciferase Reaction Reagent II：

用Luciferase Reaction Buffer II（10 ml）稀释、混合Luciferase Reaction Substrate II（短暂离心再开盖），分装、避光保存，避免反复冻融。

 

2.裂解细胞

 

细胞裂解时密度应小于95%，细胞生长过密，易导致裂解不充分；质粒瞬转、病毒感染细胞后，需培养一段时间（一般48小时）使萤光素酶充分表达；调节实验参数，以满足上述条件；

 

去除培养基，用PBS润洗一遍，注意不要将细胞吹起；加入适量的1X Lysis Buffer，推荐用量见下表；

 

 

 

将细胞培养板置于摇床上，室温、轻晃孵育15分钟；

 

将裂解物转移到新的EP管中，4℃、12,000rpm离心1分钟，取上清备用。

 

3.萤光检测

 

取20μl裂解物，加入100μl平衡至室温的Luciferase Reaction Reagent，混匀后于酶标仪中检测fLuc信号；

 

然后加入100μl平衡至室温的Luciferase Reaction Reagent II，混匀后于酶标仪中检测rLuc信号。