原代 T 细胞分离培养及病毒感染操作手册
汉恒生物独家研发适用于原代T细胞的病毒有：慢病毒、逆转录病毒（mTRv和hRv）和悬浮细胞专用的腺病毒（Ads）。其中逆转录病毒感染细胞具有物种特异性，适用小鼠原代T细胞的为mTRv，适用人原代T细胞的为hTRv。逆转录病毒可以用来构建稳转系。专用腺病毒Ads不区分物种，对人、小鼠等物种的原代T细胞均具有很高的感染效率，另外，Ads也非常适用感染其他悬浮细胞，如Jurkat，K562，HL-60和L1210等，Ads专用腺病毒不适合用来构建稳转系，详情请参考“汉恒悬浮细胞专用腺病毒操作技术文档”。
一. 小鼠脾脏细胞悬液制备
1. 脱颈处死小鼠，腹部朝上正体位暴露小鼠右侧腹部。
2. 75％乙醇消毒，剪开腹部切取脾脏。
3. 将脾脏放入预先放置好cell strainer（FALCON，352350）并已加入5ml 无菌PBS的六孔板或培养皿中。
4. 用无菌注射器柄充分研磨脾脏。
5. 弃掉cell strainer，轻柔吹打细胞至充分重悬，收集到一无菌15 ml离心管中，于4℃ 400g，离心5 min。
注：一旦取出脾脏，请置于冰上操作。
6. 将第5步离心后弃上清的脾脏细胞用5 ml无菌ACK裂解液轻柔充分吹打混匀，于冰上裂解5 min。
注：ACK裂解液配方如下表，配好之后用0.22 μm的滤膜过滤，4℃保存不超过1月
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配制 500 ml 1´ACK buffer |
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NH₄Cl |
4.1 g |
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KHCO3 |
0.5 g |
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0.5 M EDTA-2Na |
100 ml |
7. 裂解结束后加入10 ml无菌PBS终止裂解反应，于4℃ 400g离心5 min。
8. 弃上清，用10 ml无菌PBS洗一次，弃上清后直接加入培养基重悬计数，一只脾脏可得3-10´107个细胞。
注：如果要进行下一步的分离CD4+T细胞操作，请直接按照说明书将细胞重悬在合适体积的PBS中。
二. 人PBMC细胞制备
1. 取一15 ml离心管，加入2 ml已用抗凝剂处理过的人血液样品，再加入等体积的PBS进行稀释（终体积4 ml）。
注：若为经过处理的浓缩血液样品，请按照新的稀释倍数合理稀释。为了保证分离细胞的活力和效率，请使用新鲜血液，血液样品请于18-20℃保存。
2. 上下颠倒或用枪混匀样品，备用。
3. 上下翻转确保Ficoll-Paque PLUS (GE)分离液彻底混匀，去掉聚丙烯瓶盖，使用注射器针头插入瓶塞吸取3 ml分离液。
注：分离之前请将Ficoll-Paque PLUS分离液预热至18-20℃。
4. 取一新的无菌15 ml离心管，加入3 ml 步骤3中取出的分离液。
5. 小心加入稀释好的4 ml血液样品，不要打破Ficoll-Paque PLUS液面。
注：可将离心管倾斜至与水平台面呈30°，缓慢沿管壁加入血液样品。
4．将离心管小心竖直放入离心机内，于18-20℃，400g离心30-40 min。
注：特别注意将离心机的降速加速度调到0。
6. 小心取出离心管。此时液体分为3层，中层为分离液层，最下层为红细胞，最上层为血浆。位于中层靠近血浆层的白膜层即为单个核细胞层，小心吸走血浆层，不要打动白膜层。
注：可吸出最上层的血浆层保存以备后续使用。
7. 用无菌移液枪将白膜吸到一新的离心管中。
8. 用三倍体积（约6 ml）的无菌PBS重悬步骤7中的PBMC，重悬时用枪轻柔吹散，于18-20℃，400g离心10-15 min，重复一次，最后用培养基重悬备用，多余的PBMC可以冻存继续使用。
特注：在较高的离心速度下（400-500g）可以提高PBMC的得率，同时需注意在较低的离心速度下（60-100g）可以分离掉不需要的血小板。另外如上操作和比例适用于更大体积的分离。
三. CD4+ T 细胞体外刺激
1. 按照小鼠或人源CD4+ T 细胞分离kit (Thermo) 说明书分离得到CD4+ T 细胞。
2. 取所需体积的PBS，按照5 μg/ml的终浓度加入Anti-mouse CD3e和Anti-mouse CD28抗体，500 μl/孔包被 Non-Treated 24-well plate，室温放置4h，吸掉抗体悬液，加入500 μl 1% BSA（PBS配置）室温封闭30 min，封闭结束加入500 μl PBS洗孔一次。
注：请在分离细胞的同时准备好平板，包括后续感染所需的量。
3．将分离得到的CD4+ T按照浓度5´105 cell/ml重悬在完全T细胞培养基中（1640, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 50 mM β-mercaptoethanol, 100 U/ml IL-2），将细胞加入步骤2中包被处理好的平板，2 ml每孔（1´106 cell/well），然后放入37℃ CO2培养箱刺激培养48h。细胞在刺激24h后体积略微增大，进入活化状态，刺激48h后可进行病毒感染。
四. CD4+ T细胞感染（以过表达GFP的病毒为例）
1. 收集活化好的CD4+ T细胞，400g离心5min。用T细胞培养基重悬计数备用，在收集的过程中发现有些细胞会贴壁，此为正常现象，可反复吹打至贴壁的细胞也呈悬浮状态。
2. 另取一Anti-mouse CD3e和Anti-mouse CD28抗体包被好的24孔板，每孔加入2-5´105的细胞（若为96孔板，加入2´104细胞/孔）。若考虑长期表达目的基因，按MOI=50-100加入汉恒生物T细胞专用逆转录病毒mTRv-GFP或者hTRv-GFP，注意鼠源和人源原代T细胞所适合的逆转录病毒种类差别；若考虑瞬时（一周以内）表达目的基因，可按MOI=500-1000加入汉恒悬浮细胞专用腺病毒Ads-GFP。同时加入polybrene至终浓度6 ug/ml，最终感染体积为500 ul，加入病毒后轻轻吹打混匀。
注：具体MOI选择可在96孔板中预实验进行梯度摸索，对于逆转录病毒建议使用10，30，100的梯度进行，对于腺病毒建议使用500，1000，1500的梯度进行摸索。
3. 24-well plate于1000 g 室温离心感染90 min。离心结束后将平板放入37℃ CO2培养箱感染6 h。
注：离心结束观察细胞分散状态，除非细胞全聚集在一处，否则不建议吹散细胞。
4. 感染结束后取出培养板，小心吸掉感染孔中350ul的培养基（70%），加入1.85 ml的T细胞完全培养基补足体积为2 ml并吹打混匀。
5. 可选步骤：病毒感染24h后，小心吸掉培养基，在同一培养皿中按照2-4步进行病毒复感染操作。
6. 将细胞放入37℃ CO2培养箱继续培养，2-3天后可观察荧光，做流式检测感染效率。正常情况下，汉恒生物提供的T细胞专用逆转录病毒（mTRv和hTRv）和悬浮细胞专用腺病毒（Ads）感染原代T细胞的效率大于50%。
注：感染后刺激的细胞增殖较快，请注意观察细胞密度并使其维持在1´106/ml左右。此外，如果需要让细胞增殖较长时间，为了防止其过度活化，可撤掉抗体的刺激。
五. 原代T细胞病毒感染结果(见下)
汉恒原代T细胞感染实例——使用悬浮细胞专用腺病毒ads感染
悬浮细胞专用腺病毒Ads感染小鼠原代CD4+ T细胞
细胞：小鼠原代CD4+ T细胞
刺激方式：CD3/CD28抗体和IL-2激活48h
病毒：Ads-GFP, 1×10^10 PFU/ml
使用方式：MOI=500
悬浮细胞专用腺病毒Ads感染人原代CD4+ T细胞
细胞：人原代CD4+ T细胞
刺激方式：CD3/CD28抗体和IL-2激活48h
病毒：Ads-GFP， 1×10^10 PFU/ml
使用方式：MOI=100
汉恒原代T细胞感染实例——使用慢病毒和逆转录病毒感染
原代T细胞专用病毒-慢病毒感染人原代CD4+ T细胞
细胞：人原代CD4+ T细胞
刺激方式：CD3/CD28抗体和IL-2激活48h
病毒：hTLv-GFP，1*10^8 TU/ml
使用方式：MOI=50
原代T细胞专用病毒-逆转录病毒感染小鼠原代CD4+ T细胞
细胞：小鼠原代CD4+ T细胞
刺激方式：CD3/CD28抗体和IL-2激活48 h
病毒：T细胞专用逆转录病毒mTRv-GFP，1×108 TU/ml
使用方式：MOI=100
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