lncRNA研究技术手册文件下载

一、lncRNA概述

lncRNA (Long noncoding RNAs, lncRNAs) 长链非编码RNA， 起初被认为是基因组转录的不具有生物学功能的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物。然而，近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，lncRNA的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。随着研究的推进，各类 lncRNA 的大量发现，lncRNA 的研究将是 RNA 基因组研究非常吸引人的一个方向，使人们逐渐认识到基因组存在人类知之甚少的“暗物质”。

lncRNA的功能分为3方面：

1）通过修饰染色体参与表观调节-与mRNA相互作用；

2）通过与转录因子的相互作用参与转录调节-与蛋白（转录因子）相互作用；

3）通过影响mRNA处理过程参与转录后调节-ceRNA作用模式。

三种lncRNA机制作用方式，1和2主要发生于细胞核，3则发生在胞质。从研究难度来说，1>2>3：1）的RNA interaction与array并无成熟的研究模式；2）需要RIP和RNA pull-down，实验执行难度大风险高；3）转录后调节的研究方法-ceRNA作用模式可行性及阳性率较高，是目前研究最热门的lncRNA作用方式。

lncRNA的ceRNA作用模式：lncRNA作为竞争性内源RNA(competing endogenousRNA，ceRNA)，与microRNA结合，在细胞中起到microRNA海绵的作用。从而降低microRNA的活性，间接上调microRNA相关靶基因的表达。

图：lncRNA的ceRNA作用模式

二、汉恒生物-lncRNA研究专家

汉恒生物lncRNA研究团队，为您提供基于ceRNA调控机制的lncRNA系统研究方案。大致流程如下：

1）验证lncRNA的表达水平和细胞内亚定位；

2）通过网络数据库，预测lncRNA可能结合的miRNAs；

3）lncRNA结合的miRNAs的信息学筛选及荧光素酶进一步筛选验证；

4）miRNA靶基因预测与功能富集分析；

5）miRNA靶基因的筛选、验证及相关功能研究；

6）lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的验证。

图2 汉恒生物lncRNA研究流程示意图

三、汉恒生物-lncRNA研究实例

四、研究步骤解析：

1、验证lncRNA的表达水平和细胞内亚定位：

汉恒生物拥有成熟的lncRNA-qPCR验证技术，可验证HOTAIR在不同样本中的表达差异性（如肺癌组织和癌旁组织样本），本例中，HOTAIR在癌组织中的表达量高于癌旁组织。qPCR筛选HOTAIR内源表达丰度高的肺癌细胞系用于后续细胞功能学实验。由于lncRNA-miRNA-mRNA调控机制的前提是lncRNA在细胞质表达，汉恒生物提供的核质分离和qPCR技术，可确定HOTAIR是否在细胞质中表达。

2、通过网络数据库，预测HOTAIR可能结合的miRNAs：

3、lncRNA结合的miRNAs的信息学筛选及荧光素酶进一步筛选验证：

将HOTAIR序列克隆构建至报告基因载体psiCHECK，合成上述预测到的miRNA mimics及对照，在293T细胞内同时转染miRNA mimics和psiCHECK- HOTAIR，多功能酶标仪检测报告基因的表达水平，并筛选报告基因表达下调的miRNAs（可能有多个，本例中假定选择hsa-miR-17-5p进行后续研究）。

4、miRNA靶基因预测与功能富集分析：

   对hsa-miR-17-5p进行靶基因预测，结果如下：

通过功能富集分析将肺癌相关的基因筛选出来：

5、miRNA靶基因的筛选、验证及相关功能研究：

（1）初筛：qPCR验证靶基因在癌组织和癌旁组织中的表达量差异，筛选与lncRNA表达呈正相关的靶基因（本例选择在癌组织中高表达的靶基因）；

（2）进一步筛选：在肺癌细胞系中下调HOTAIR表达（使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具），qPCR验证上述靶基因表达水平。选择HOTAIR干扰后，表达量也明显下调的靶基因作为研究对象，本例中假定为CDK6基因。查询CDK6的功能，发现它主要与细胞周期相关。

（3）在肺癌细胞系中过表达hsa-miR-17-5p（使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具），WB和qPCR检测CDK6的表达水平；

（4）在肺癌细胞系中过表达hsa-miR-17-5p（使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具），通过细胞周期和细胞增殖等实验，确定hsa-miR-17-5p对细胞功能的影响；

（5）双荧光素酶报告基因实验：构建CDK6 3’UTR报告基因载体，将hsa-miR-17-5p mimics与报告基因载体共转293T工具细胞，多功能酶标仪检测报告基因的表达水平，阐明hsa-miR-17-5p作用于CDK6的分子机制；

注：为了实验的严谨性，可加入CDK6 3’UTR区hsa-miR-17-5p预测结合区域的突变体作为对照，进一步说明问题。

6、肺癌细胞系中干扰HOTAIR，检测CDK6表达水平及细胞功能学研究：

在肺癌细胞系中干扰HOTAIR（使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具），然后分别进行如下实验：

1）WB和qPCR检测CDK6表达水平；

2）qPCR检测hsa-miR-17-5p表达水平；

3）细胞周期和细胞增殖等实验，研究HOTAIR对细胞功能的影响；

7、lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的验证：

汉恒生物-lncRNA-miRNA-mRNA调控机制研究解决方案：基于ceRNA作用方式和双荧光素酶报告基因实验，证明lncRNA可rescue下游miRNA对其靶基因的抑制作用。

本实例的具体流程如下：

（1）构建HOTAIR报告基因载体，将它和hsa-miR-17-5p mimics共转至293T工具细胞中，多功能酶标仪检测报告基因的表达水平，直接证明HOTAIR对hsa-miR-17-5p的海绵吸附机制；

（2）使用步骤5（5）中构建的CDK6 3’UTR报告基因载体，并构建HOTAIR过表达载体，将两者共转至293T工具细胞中，多功能酶标仪检测报告基因的表达水平，可间接证明HOTAIR通过海绵吸附hsa-miR-17-5p，从而上调CDK6靶基因的表达。

注：为了实验的严谨性，上述双荧光素酶实验可分别加入HOTAIR序列或CDK6 3’UTR区hsa-miR-17-5p预测结合区域的突变体作为对照，进一步说明问题。

五、参考文献：

1、Long noncoding RNAs: functional surprises from the RNA world. Wilusz JE, Sunwoo H, Spector DL. Genes Dev. 2009 Jul 1;23(13):1494-504.

2、A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA.Cesana M, Cacchiarelli D, Legnini I, Santini T, Sthandier O, Chinappi M, Tramontano A, Bozzoni I. Cell. 2011 Oct 14;147(2):358-69.

3、The long noncoding RNA CASC2 functions as a competing endogenous RNA by sponging miR-18a in colorectal cancer. Huang G, Wu X, Li S, Xu X, Zhu H, Chen X. Sci Rep. 2016 May 20;6:26524.

4、Long noncoding RNA BC032469, a novel competing endogenous RNA, upregulates hTERT expression by sponging miR-1207-5p and promotes proliferation in gastric cancer. Lü MH, Tang B, Zeng S, Hu CJ, Xie R, Wu YY, Wang SM, He FT, Yang SM. Oncogene. 2016 Jul 7;35(27):3524-34.

5、Lnc RNA HOTAIR functions as a competing endogenous RNA to regulate HER2 expression by sponging miR-331-3p in gastric cancer.Liu XH, Sun M, Nie FQ, Ge YB, Zhang EB, Yin DD, Kong R, Xia R, Lu KH, Li JH, De W, Wang KM, Wang ZX. Mol Cancer. 2014 Apr 28;13:92.

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