Mir前体克隆文件下载

Mir前体克隆步骤

1、首先进入mirbase网站http://www.mirbase.org/

2、search需克隆的mir（以has-mir-143为例）

   如下图找到工具栏的“search”按钮，单击进入：

在接下来弹出的对话框中输入hsa-mir-143，单击“提交查询内容”

弹出以下画面：

 单击Stem-loop中的按钮即可获得所需的hsa-mir-143前体序列。

单击Genome context中 

在弹出的画面中单击即可获得mir所在的基因组信息。

3、获得mir前体基因组序列并克隆

克隆的时候一般往上下游推。如下图：上下游各300bp，一般长一点短一点都可以，总长度300bp以上就差不多：

单击即可获得mir前体基因组序列。

以此序列为模板，primer5设计引物并加入酶切位点(设计引物时，最好将mir前体序列置于整个PCR目的产物的中部附近，不要太靠近PCR目的产物的末端)。

4、设计好的引物还可以在NCBI验证其准确性

以hsa-mir-143为例，设计好的引物如下：

Forward：GGTCAAGGTTTGGTCCTGGGTGCTC

Reverse：AGGGTGCTGGGGAAATGCTAACGCC

首先进入NCBI网站主页

单击按钮，进入Basic BLAST页面

单击按钮，进入如下界面，并将上述设计好的引物输入方框内，如下图选择

单击按钮：如下图所示，第一个全绿色的是与上述引物完全匹配的基因组，其余颜色均不完全匹配。

这时只要查询这个对应的基因组是否为hsa-mir-143前体序列即可。