慢病毒包装步骤
一、整体实验流程
二、实验材料
（一）慢病毒载体、慢病毒包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLVTM系列质粒。
1、载体信息（见附表1）
2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株：大肠杆菌菌株DH5α用于扩增辅助包装载体质粒；Stbl3用于扩增pHBLVTM系列质粒，防止病毒载体重组。
三、慢病毒包装和浓缩
(一) 质粒扩增
构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1 mg/ml，A260/280在1.7-1.8间方可用以病毒包装。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。
(二) 做脂质体转染
转染前一天，按照5´106/T75的密度铺下293T细胞。24h后转染。转染前请把DMEM和转染试剂LipoFiterTM恢复至室温，使用前需摇匀。转染每瓶T75的质粒成分如下：
请参考LipoFiterTM转染试剂说明书进行转染操作。转染后6 h换新鲜培养基。
注：LipoFiterTM转染试剂为汉恒生物研制的DNA转染试剂产品，使用说明请参考LipoFiterTM说明书。
(三) 病毒收集和离心
转染后48h和72h分别两次收集病毒上清(48h收集后置换新鲜培液)，收集后以0.45 μm滤器过滤,于40 ml超速离心管中，4℃，72000´g离心120 min。
(四) 病毒重悬和保存
500 ml 新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于-80℃甚至液氮保存。
附1：汉恒生物慢病毒质粒列表（质粒图谱请登陆汉恒官网www.hanbio.net查询）
载体名称 | 用途 | 启动子 | 容量 | 抗药标记 | 荧光标记 |
pHBLv-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A -puro | 过表达 | CMV | 2.5kb | Puromycin | RFP |
pHBLv-CMV-MCS-EF1-ZsGreen -T2A-puro | 过表达 | CMV | 2.5kb | Puromycin | ZsGreen |
pHBLV-CMV-MCS-EF1-Luc-T2A -Puro | 过表达 | CMV | 2.0kb | Puromycin | Luc |
pHBLV-CMV-MCS-EF1-Puro | 过表达 | CMV | 3.0kb | Puromycin | 无 |
pHBLV-CMV-MCS-T2A-Puro | 过表达 | CMV | 3.0kb | Puromycin | 无 |
pHBLV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen | 过表达 | CMV | 3.0kb | 无 | ZsGreen |
pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A -Puro | 过表达 | CMV | 3.0kb | Puromycin | RFP |
pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A -Puro | 过表达 | CMV | 2.5kb | Puromycin | GFP |
pHBLV-Tet-on-SV40-puro | Tet-on过表达 | TRE3G | 1.5kb | Puromycin | 无 |
pHBLV-CMV-crRNA-EF1-GFP-T2A-puro | 环状RNA过表达 | CMV | 2.5kb | 无 | GFP |
pHBLV-U6-MCS-EF1-mCherry-T2A-puro | 干扰 | U6 | shRNA | Puromycin | mCherry |
pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-Puro | 干扰 | U6 | shRNA | Puromycin | ZsGreen |
pHBLV-U6-MCS-EF1-Luc-T2A -Puro | 干扰 | U6 | shRNA | Puromycin | Luc |
pHBLV-U6-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-Luc | 干扰 | U6 | shRNA | 无 | ZsGreen/Luc |
pHBLV-U6-MCS-EF1-RFP-T2A-Luc | 干扰 | U6 | shRNA | 无 | RFP/Luc |
pHBLV-U6-MCS-EF1-Luc-T2A-Bla | 干扰 | U6 | shRNA | Blasticidin | Luc |
pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen | 干扰 | U6 | shRNA | 无 | ZsGreen |
pHBLV-U6-MCS-PGK-puro | 干扰 | U6 | shRNA | Puromycin | 无 |
pHBLV-EF1a-cas9-U6-gRNA-puro | Cas9/gRNA | EF1a/U6 | Cas9/ gRNA | Puromycin | 无 |
pHBLV-EF1a-cas9-CMV-puro | cas9 | EF1a | Cas9 | Puromycin | 无 |
pHBLV-U6-gRNA-EF1a-puro | gRNA | U6 | gRNA | Puromycin | 无 |
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