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腺病毒包装流程及操作

重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达 100%，可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；对外源基因容载能力大（可以高达 8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。

目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒5型（Ad5），其基因组是36Kb长的线性双链DNA。腺病毒可通过自身的纤维（fiber）和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。

目前最常用的腺病毒包装体系有AdEasy和AdMAX两种，其共同特点是目的基因首先克隆到穿梭载体，然后再重组到腺病毒的大骨架上。这两个系统均具有腺病毒早期转录复制基因E1和E3的缺陷(ΔE1, ΔE3)，其中E3基因对病毒产生并非必需。因此，腺病毒包装必需依赖表达E1的细胞系，例如HEK-293，HEK-293A等。

相对于Adeasy系统，AdMAX系统操作便利，并且可以获得更好的病毒滴度。本操作说明均基于AdMAX系统，该系统由pHBAd系列穿梭质粒、腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E1, 3Cre双载体组成。

一、整体实验流程

二、实验材料

该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（pHBAd系列，包括包括过表达、干扰等类型）和骨架质粒（pBHGlox(delta)E1, 3Cre)。

1、载体信息（见附1）

2、菌株：大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。

3、细胞株：293A，腺病毒的包装细胞，表达腺病毒基因E1，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗（DMEM完全培养基）。293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过 70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。

若细胞密度持续在 70% 以下，则293A细胞能连续培养3～4个月维持原有的细胞特性。若以购买得到的293A作为第一代，则30代内都能得到最佳结果。随着传代次数的增加，293A细胞会出现生长状态变差、突变等现象。为了防止此类现象的出现，我们需要在初始阶段对细胞进行大量的冻存保种，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，可增加细胞复苏成活率。

注：为了达到最好的细胞状态，提高腺病毒出毒效率，推荐在培养基中加入汉恒生物的SaveIt^TM抗支原体试剂。

三、腺病毒包装和浓缩

（一）质粒构建和扩增

构建有目的基因的腺病毒穿梭质粒和骨架质粒需经过大量抽提，浓度要求大于 1 mg/ml，A260/280在1.7~1.8范围内方可用于病毒包装。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。

注：质粒构建推荐使用汉恒生物HB-infusion^TM无缝克隆试剂盒。

（二）腺病毒包装

事先准备好用于包装病毒的293A细胞（50-70%的汇合度）和病毒质粒，转染每个直径为6 cm的培养皿成分如下：

DMEM需在 37℃水浴中预热，LipoFiter^TM转染试剂需恢复至室温方可使用，并在使用前摇匀。转染 6h后置换成新鲜培养液。

注：1、LipoFiter^TM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipoFiter^TM说明书。

    2、转染前细胞必须处于良好的生长状态。

（三）病毒收集

病毒收集前要观察病毒空斑是否形成。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地形成，通常在培养液中加入低熔点琼脂糖，转染后一般在第10至21天可以在显微镜下看到小的空斑。如果穿梭质粒带有荧光蛋白（GFP或RFP），则在空斑形成之前观察荧光，以确定转染效率。空斑形成后将空斑与琼脂糖一起挑起，放入1 ml新鲜培养基中过夜。通常挑取3-6个空斑不等，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。

空斑示意图

注：高纯度的低熔点琼脂糖储液可以配制在无菌PBS中，终浓度5%；使用之前用沸水浴完全融化，然后自然降温到45℃待用。用37℃预热的完全培养基稀释5%的琼脂糖溶液到终浓度1.25%，混匀后马上加到去除培养基的细胞上，轻轻地覆盖均匀。6孔板每孔覆盖3 ml琼脂糖/培养基。

（四） 病毒扩增

第二天，将培养基中病毒加入新鲜293A细胞培养液中进行病毒少量扩增。至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1代病毒，以P1代腺病毒感染293A细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。

注：1、收集细胞的时候一般使用细胞刮，不能用胰酶消化，4℃ 500´g离心10 min，去除大部分上清，只留取 2 ml上清重悬细胞沉淀进行 -80℃（干冰或者液氮均可）冻融。

2、37℃冻融时一旦病毒融化就马上取出，长时间在37℃温育会降低病毒滴度，完全融化后可以剧烈震荡 30s。冻融周期通常会持续2~4次才可以获得高滴度的病毒。

3、细胞冻融结束裂解液可以 4℃ 500×g离心10 min，不立即使用的话可以冻存在 -20℃或 -80℃。

（五）病毒纯化

病毒纯化采用PEG8000沉淀-CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，具体操作如下:

1、融化：提前 1 天将病毒从 -80℃冰箱拿出，室温水浴融化。收集全部细胞裂解物，7000×g 4℃离心10 min，弃细胞碎片，收集上清。

2、PEG8000沉淀：每100 ml上清加入50 ml PEG8000（20% PEG8000，2.5 M NaCl），冰上放置 1h使病毒沉淀（可适当延长时间）。7000×g 4℃离心上述混合物 20 min，弃上清，将沉淀物悬浮在 10 ml 密度为 1.10 g/ml 的 CsCl 溶液中（溶剂为20 mM Tris-HCl，PH8.0）（溶液配置见下表）， 病毒液应呈粉红色。

三种不同密度CsCl溶液的配制

3、CsCl 梯度离心：CsCl 梯度的制备方法如下：加入 2 ml 密度为 1.40 g/ml 的 CsCl 溶液（溶剂同上），然后再缓慢加入 3 ml 密度为 1.30 g/ml 的 CsCl 溶液（配置如下表），再加入 5 ml 的病毒悬浮液。使用Beckman SW28转子，26,000 rpm，4℃离心2小时。

4、收集病毒：用注射器收集密度在 1.30 g/ml 和 1.40 g/ml 之间的病毒条带至透析袋中。

注：透析袋使用前用 10 mM EDTA-Na₂煮沸10 min，降至室温使用。

5、透析：在透析缓冲液（50 g 蔗糖，10 ml 1M Tris-HCl，PH8.0，2 ml 1M MgCl₂定容至 1L）中，4℃搅拌过夜，中间需更换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。

6、重悬：500 μl PBS重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4℃保存，如需长时间存放需置于-80℃保存。