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腺病毒感染目的细胞

因为不同细胞的MOI不同，所以在正式实验前，需设计预实验以确定目的细胞中加入的病毒数。

注：MOI值: MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒颗粒所感染。不同实验室、不同操作手法及不同细胞系条件下所对应的细胞最佳MOI都是不同的，在正式实验之前强烈建议实验操作者进行一次摸索最佳MOI的预实验。

（一）细胞准备

将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞密度约为1×10⁵/ml。

注：接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率在50%至70%之间。

（二）病毒感染细胞（腺病毒感染细胞系的话可以略过纯化操作步骤）

感染之前，请按照梯度稀释病毒（附2），一般感染时MOI控制在3~1000区间范围。

1、感染贴壁细胞

感染实验分为两组，分别添加带目的基因的腺病毒和等滴度同体积的对照病毒，常用孔板参数如下表（简而言之，就是把一定体积的病毒直接加入到完全培养基中即可）。加入的病毒量范围在MOI=3～1000，一般设置MOI摸索梯度为3，10，30，100，300，1000（详见附2）。每个MOI值加两个孔，4~8h后更换成新鲜完全培养基。

举例：假如收到的病毒滴度为5´10¹¹PFU/ml, 首先用完全培养基稀释到5´10¹⁰PFU/ml（1：10稀释）。现在要感染细胞数1´10⁵/孔一个孔，MOI=1000，则需要5´10¹⁰PFU/ml病毒的体积=1´10⁵´1000/5´10¹⁰ ml=2μl。直接吸取2 μl的5´10¹⁰PFU/ml病毒混入孔板的培养基中即可。混匀后继续培养4-8 hr后更换新鲜的完全培养基。48-72hr可以观察荧光、WB等实验。

注：遗弃的废液按照病毒废液来处理！

2、感染悬浮细胞

感染悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后，低速（200×g）离心1 h，然后放入培养箱中正常培养即可。若实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置15 min（不要超过30 min），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续培养，感染过夜后换液即可。

（三）观察感染情况

感染48~72h后，可开始观察到GFP/RFP的表达；也可通过qPCR和WB验证目的基因在基因水平和蛋白水平的表达情况。