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基因克隆

(1) 目的基因片断扩增

1．引物设计

利用DNAMAN等软件设计合适的引物, 并根据目的基因内切酶位点分析结果，分别在正、反向引物的5’端加上相应酶切位点，并分别加上内切酶保护碱基。

2．按照如下体系进行PCR扩增，测试引物

扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

3. 按照如下体系高保真扩增启动子DNA

50ul体系：

扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

（2）目的基因片断回收（离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒）

1．配制1%琼脂糖凝胶，然后将PCR产物全部点入胶孔，进行琼脂糖凝胶电泳。

2．在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。

3．用电子天平称量凝胶的重量，以1 mg=100ul换算凝胶体积。

4．加入3倍胶体积溶胶液，50℃水浴放置10分钟，其间不断上下翻转（温和的）至胶完全溶解，放置至室温（这步很重要，因为高温不利于DNA吸附）。

5．将已经溶解的溶液加至吸附柱，并将吸附柱放入收集管中，8000rpm离心30s；将收集管中的液体重复加至吸附柱，8000rpm离心30s，将收集管中的废液倒掉。

6．向吸附柱中加入700ul漂洗液（确认已加入乙醇），12000rpm离心30s，将收集管中的废液倒掉。向吸附柱中加入500ul漂洗液重复操作一次。

7．12000rpm 离心2min ，尽量去除漂洗液，在37 ℃培养箱中晾5分钟。

8．吸附柱放入一个干净的离心管，加入30ul 65~ 70℃预热的ddH2O，室温下静置2min，13000rpm离心1min。将离心得到的溶液加入吸附柱中重复操作一次。

9．1%琼脂糖凝胶电泳检测并根据marker的上样量估计回收产物的浓度。

（3）目的片断连入pGEM-T easy 载体（或直接进入（4）酶切）

① PCR扩增产物末端加腺嘌呤核苷酸（A）

1．取用KOD-plus聚合酶扩增的PCR产物1ul，加至10ul Taq PCR 体系。

2．70℃温育15到30分钟

② PCR产物连接入pGEM-T easy载体

           连接体系

X的值为：

载体质量（ng） × 插入片断大小（Kb）×[ 插入片断：载体的摩尔比（3：1）]

                                   载体的大小(Kb)

最后补水至10ul

同时设立对照组：

（4）对载体和回收得到的目的基因片断进行酶切

1. 在Fermentas网站上（http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html）确认所用内切 酶双切体系。一般酶用量为10U/ug；酶的体积不能超过酶切体系的十分之一；体积允许的情况下用30ul酶切体系。以下以EcoRⅠ- VspⅠ双切为例。

2. 载体酶切体系

同时设立两个对照：

370C酶切3个小时；1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

3.　目的基因片断酶切体系：

370C酶切2个小时； 1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

4．载体和目的基因片断回收

1．方法如上述。

2．回收电泳是对insert和vector进行定量，确定其相对质量比例。根据相对分子量换算为两者摩尔比。

（5） 回收产物酶切进行连接反应

连接反应体系：

同时设立自连对照：

23℃连接1小时，或16℃连接过夜。

注：对于大小在500bp -1500bp的片段，可以不定量按照上述标准体系连接。连接体系总的DNA量在50-250ng。

（6） 连接产物转化感受态大肠杆菌（E.coli）

1．从-70℃冰箱中取出感受态E.coli（100ul一管），立即放入冰中。

2．5分钟之后感受态E.coli开始溶化时分装为50ul/tube，加入连接产物10ul，冰上放置20min。

3．42℃水浴60-90s；之后冰上放置2分钟（这一步注意动作尽量轻）。

4．加入新鲜的无选择性LB培养基450ul，37℃水浴60分钟。

5．4000rpm离心5min，留100ul上清

6．取Kan/Amp抗性LB平板，加入100ul转化后的感受态大肠杆菌（E.coli）涂板，37℃培养箱培养14-16小时。

7．第二天观察结果，从转化的细菌平板中挑取中等大小，饱满而且没有和其他克隆相接触的单克隆，接种到3ml 卡那霉素选择性LB培养基中。置于37ºC恒温摇床培养14~16个小时。准备质粒的小量抽提。

（7） 阳性克隆鉴定

① 菌落PCR法

1． 配Taq PCR体系母液，按每个平板挑8管，20ul/管计算。

2． 取一PCR排管，每孔加入ddH2O 10ul，做好相应编号；另外准备相应抗性的干净平板一块，做好编号标记。

3．用小枪头从转化的细菌平板中挑取中等大小，饱满且没有和其他克隆相接触的单克隆，在平板上相应编号处轻点一下接种，然后放入相应编号的ddH2O管中。

4．接种平板放入370C培养；取2ul菌悬液进行PCR，剩余8ul菌悬液保存在40C

5．鉴定为阳性的克隆，将8ul菌悬液接种到3mlKan/Amp选择性LB培养基中。置于37ºC恒温摇床培养14~16个小时。若时间间隔过长未摇出菌，可第二天用保种平板接种摇菌。

5．送测序。

② 快速抽提质粒法鉴定

1．从转化的细菌平板中挑取中等大小，饱满而且没有和其他克隆相接触的单克隆，接种到3ml Kan/Amp选择性LB培养基中。置于37ºC恒温摇床培养8小时以上。

2．取30ul菌液（菌较少时可离心后重悬至30ul）加入等体积酚/氯仿，Vortex数次。

3．加入5ul Loading Buffer。

4．12000rpm离心10min（40C）

5．取上清电泳，同阳性Vector比较大小。

5．大小正确的送测序或进一步酶切鉴定。

③ 抽提质粒酶切鉴定

（1）质粒的小量抽提（采用QIANGEN质粒纯化试剂盒进行质粒的小量抽提）

1．取1.5 ml菌液，14000 rpm离心2分钟，然后弃去上清。

2．悬浮：加入P1溶液200 ul，然后使沉淀的菌体悬浮。

3．裂解：加入P2溶液200 ul，然后颠倒4~6次。

4．中和：加入P3溶液200 ul，然后颠倒4~6次。

5．12000 rpm冷冻离心10分钟，然后小心吸取上清液于另一洁净离心管内。

6．加入420 ul异丙醇，混匀，12000 rpm冷冻离心15分钟，然后弃去上清。

7．加入70%乙醇200 ul，冷冻离心5分钟。

8．取出晾干，大约5分钟左右。

9．加入20 ul TE缓冲溶液，反复吹吸50次左右，使质粒DNA溶于TE缓冲溶液之中。取少量样品进行琼脂糖凝胶电泳。

（2）小量抽提质粒内切酶酶切鉴定

选取插入片段上和载体上都有的酶切位点，取相应量质粒进行酶切，看是否符合预计片段大小。

（8）质粒的大量抽提 (采用QIAGEN质粒纯化试剂盒进行质粒的大量抽提)

1．从转化的细菌平板中挑取中等大小，饱满而且没有和其他克隆相接触的单克隆，接种到3ml Kan选择性LB培养基中。37ºC恒温摇床培养14~16个小时。

2．从小量培养物中取1 ml用作小量抽提，然后作酶切鉴定，选取阳性克隆的培养物，以1：500的比例接种到200 ml选择性LB培养基中。37ºC恒温摇床培养14~16个小时。

3．从大量培养物中取700 ul菌液，再加入300ul甘油冻存。

4．把200 ml菌液倒入250 ml离心管中，4ºC，8500rpm离心15分钟。

5．弃去上清，然后倒扣于吸水纸上片刻。然后加入5 ml 4ºC预冷的细胞重悬液buffer P1（确认已经加了Rnase），反复吹打沉淀至没有悬浮的菌块为止。然后将悬浮液转移到50 ml的离心管中。

6．加入5 ml细胞裂解液buffer P2，彻底且轻柔地颠倒4~6次，在室温下孵育不要超过5分钟（从加入buffer P2开始计时，时间过长会使质粒DNA断裂）。注意：样品不要涡旋，否则会有基因组污染。buffer P2用完后也要及时地盖好盖子，以免被空气中的二氧化碳酸化。

7．加入5 ml 4ºC预冷的pH值调节液buffer P3，及时且轻柔地颠倒混匀4~6次，在冰上孵育15分钟。然后再混匀一次样品。4ºC，17500rpm，冷冻离心30分钟。如果上清不够清需再离心1分钟。

8．用4 ml buffer QBT来平衡层析柱。让液体自由留下。

9．然后步骤7中的上清小心的吸到层析柱中，让液体自由流下。

10．用5 ml buffer QC清洗层析柱一次，然后再加5ml buffer QC清洗层析柱。

11．用5 ml buffer QF清洗层析柱洗脱DNA，用一支50 ml离心管收集。

12．在两管洗脱液中各加入0.7倍（3.5 ml）体积的室温异丙醇沉淀DNA，并在沉淀会出现的位置作标记。离心前一定要涡旋。然后4ºC，15000g，离心30分钟。取出时保持离心管平行移动，小心倒去上清。

13．用2 ml室温的70%乙醇清洗沉淀。然后4ºC，15000g，离心10分钟。取出时保持离心管平行移动，小心倒去上清。

14．在空气中干燥沉淀5~10分钟，用400 ul TE缓冲溶液溶解沉淀。

15．测定质粒DNA的260/280值和浓度。