汉恒生物-慢病毒载体-腺相关病毒包装-自噬-双荧光素酶-转染试剂-细胞支原体污染-无缝克隆-cas9-稳定细胞株-IncRNA-环状RNA

汉恒慢病毒/逆转录病毒操作手册

一、慢病毒/逆转录病毒的分装与储存

1.收到汉恒生物慢病毒/逆转录病毒产品后，请先对慢病毒/逆转录病毒产品进行分装处理，建议20-50 μl/管。如1-2天内使用，则留足够量病毒4℃保存，余下慢病毒/逆转录病毒置于-80 ℃长期保存。

2.病毒可以存放于-80 ℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过 6个月，建议在使用前重新测定病毒滴度。

3.反复冻融会降低慢病毒/逆转录病毒滴度：慢病毒/逆转录病毒滴度越低，冻融对滴度的影响越大，10⁸TU/ml的慢病毒/逆转录病毒冻融2次滴度没有显著性差异，第3次冻融开始，每冻融一次滴度降低约10%；滴度10⁷TU/ml滴度慢病毒/逆转录病毒，从第2次冻融开始，每次冻融病毒滴度下降10%-15%。

二、慢病毒/逆转录病毒实验策略与关键知识点

（一）、慢病毒/逆转录病毒感染策略

慢病毒/逆转录病毒本身的病毒滴度不高，感染细胞时病毒消耗量较大。慢病毒/逆转录病毒感染细胞后会反转录并插入基因组形成稳转，因此慢病毒/逆转录病毒感染一般采用感染少量细胞，然后将细胞放大化培养。而不是直接大量感染。

注意：对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用腺病毒感染。

（二）、慢病毒/逆转录病毒感染关键知识点

1）细胞准备：慢病毒/逆转录病毒建稳转细胞系前，请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。慢病毒/逆转录病毒感染的时候细胞汇合率为40%～60%间为宜。

2）感染细胞最佳MOI的测定：MOI（感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。

慢病毒/逆转录病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别，原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。MOI一般以3, 10, 30, 100的比例递增进行梯度摸索。MOI梯度摸索建议使用96孔或48孔板进行，可节省病毒和细胞。

3）助转剂polybrene的选择：实验证明，polybrene可提高慢病毒/逆转录病毒对大部分细胞的感染效率，但polybrene有一定的细胞毒性，不同细胞对polybrene的敏感度不同，polybrene最常用的工作浓度为5～8 μg/ml。

注：微信扫码关注汉恒生物公众号，可查看汉恒生物针对不同细胞推荐的适合MOI范围以及polybrene适用情况。

4）MOI对应病毒体积的换算（非常重要）

感染时细胞数（一般以传代计数细胞数×2计算）×MOI=病毒个数；则加入的病毒体积数=病毒个数/病毒滴度。

比如第一天传代10⁵细胞到24孔板一个孔，第二天长到2×10⁵细胞，按照MOI=20计算，需加入病毒总量为2×10⁵×20=4×10⁶，按照慢病毒/逆转录病毒1×10⁸TU/ml的滴度，则加入的病毒体积数为(4×10⁶)/(1×10⁸TU/ml)=4×10^-2 ml=40 μl。

三、慢病毒/逆转录病毒感染细胞步骤：（1/2小体积感染法）

注：微信扫码关注汉恒生物公众号，观看汉恒生物慢病毒/逆转录病毒细胞感染实验操作教学视频。

1.感染前准备
1）按实验需要将细胞铺板（比如24孔板）37℃ 培养过夜。细胞数以第2天密度约40%～60%间为宜。

2）从冰箱取出慢病毒/逆转录病毒并在冰上缓慢融化，待完全融化后开始病毒感染实验。

2. 目的细胞的感染(1/2体积4小时感染法）

吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基，并往新鲜培养基里加入终浓度5～8μg/ml的polybrene(部分polybrene不耐受细胞除外），再根据选定的MOI值，换算对应的病毒原液体积，并按体积将病毒原液加入细胞中，摇匀

1/2体积4小时病毒感染体积表
培养皿类型	表面积/cm²	1倍细胞培养基体积	1/2培养基体积
96-well	0.3 cm²	100 μl	50 μl
24-well	2 cm²	500 μl	250 μl
12-well	4 cm²	1 ml	500 μl
6-well	10 cm²	2 ml	1 ml
60 mm	20 cm²	4 ml	2 ml
100 mm	60 cm²	10 ml	5 ml

1)针对贴壁细胞，细胞中加入病毒液后直接置于37℃培养箱感染4小时。

若目的细胞是悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法进一步促进病毒对细胞的感染性吸附，即将适量的病毒液加入细胞培养板后，封好口，放入平角离心机后，低速（500g）离心1 h，然后放入37 ℃培养箱中继续积感染3小时。

2）37℃培养箱中感染完毕后，取出细胞，直接往含病毒的培养基中加入另外1/2体积新鲜培养基（含终浓度5～8 μg/ml的polybrene，部分polybrene不耐受细胞除外）。

3）感染后第二天（约12-16小时），吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液（不含polybrene），继续37 ℃培养。

4）感染72小时后，荧光显微镜检测GFP/RFP等荧光表达效率。

5）稳转株的初筛选：如病毒载体携带puromycin抗性，感染72小时后置换含适当浓度的puromycin（1～3 μg/ml，）的新鲜完全培养液，同时准备一组普通目的细胞（简称Blank组，其细胞数量、密度和病毒感染组细胞一致），加入等终浓度的puromycin。每2-3天换含puromycin的完全培养液一次，直到Blank组细胞被puromycin杀光。

6）稳转株的二次筛选与培养放大：将puromycin终浓度减半（简称：1/2 puro培养基）培养存活的病毒感染组的细胞（包括目的基因和对照病毒组），并在细胞长密到80%左右进行细胞传代，传代后的细胞为P2代稳转株，P2代-P4代继续用1/2 puro培养基培养细胞，大量扩增细胞至4代，并大量冻存P4代的稳转细胞株，以备后续实验。