ips操作指南-慢病毒文件下载

iPS操作指南-慢病毒

iPS简介：

       iPS细胞是通过基因转染技术（gene transfection）将某些转录因子导入动物或入的体细胞使，体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stemcell,ESC）细胞样的多潜能细胞。现在大多是通过病毒携带特定的转录因子进入体细胞内，来获得多能性干细胞。2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。

       现分别介绍一下小鼠的和人的iPS的诱导步骤。

一、实验材料

慢病毒包装体系（来自汉恒生物，Hanbio^TM）：

慢病毒表达质粒plvx-OCT4、plvx -SOX2、plvx -KLF4和plvx-c-MYC（来自汉恒生物，Hanbio^TM）；

辅助质粒PSPAX2和PMD2（来自汉恒生物，Hanbio^TM）；

病毒包装细胞：293T细胞（来自汉恒生物，Hanbio^TM）；

ES Feeder细胞：MEF（C57）（来自汉恒生物，Hanbio^TM） 。

二、实验仪器和耗材

（一）实验仪器

二级安全柜、37度培养箱、4度冰箱、液氮储存器、倒置显微镜、低温离心机。

（二）实验耗材

PBS、无菌水、明胶粉、DMEM培养基、FBS、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、胰酶、血清替代物（SR）、mTESR1、T75培养瓶、无菌水、15ml离心管、50ml离心管，巴氏管等。

三、ips诱导方法

（一）Feeder细胞

1、Feeder细胞的分离（MEF）

取妊娠13.5-14.5d的孕鼠，在无菌情况下取出胎鼠，去除鼠头，尾，四肢及内脏，然后用PBS进行冲洗。

将胎体剪碎成小于1mm2的组织块，1000rpm，3min，去掉上层PBS，加入0.25%胰酶-0.04%EDTA 2~3ml浸泡组织块，常温消化2~3min。

轻微吹打，待较多细胞溢出后，加入等量的10%FBS DMEM终止消化，通过100目滤网过滤后，将获得的液体离心，1000rpm，5min。

弃上清，加入培养基重悬细胞，调整细胞密度约2x105个/ml，用10%FBS的DMEM进行培养。

2、MEF细胞的传代培养

在倒置显微镜下观察，当成纤维细胞汇合度达到80%~90%时，去掉培养基，用PBS清洗两遍，加入2ml 0.25%胰酶-0.04%EDTA消化液进行消化。

镜下观察，当细胞间出现裂隙，细胞变圆时，加入等量的MEF培养液终止消化，并用滴管反复轻轻吹打成单细胞悬液。

将单细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm离心5min，弃上清，加入MEF培养液将细胞重悬，按1:2~3传代。置于37度、5%CO2培养箱中培养。

3、Feeder制备

选择对数生长期的MEF，在培养基中加入丝裂霉素C在37度，5%CO2条件下处理2~3h，加入的丝裂霉素C浓度为0.4mg/ml, 使得终浓度为12ug/ml.

处理结束后，吸取带有丝裂霉素C的培养基，用PBS清洗细胞两次后，加入0.25%胰酶-0.04%EDTA覆盖细胞表层，37度孵育6mins。

用含有血清的培养基终止胰消化，然后将细胞重悬，吹散，细胞计数，按每个6cmdish中放入4x105个细胞或3x104个细胞每cm2分放，加入适量培养基，置于培养箱中备用。

注：至少要放置2h后才可植入ES细胞。

（二）慢病毒包装：

293T包装OCT4，SOX2，KIF4，c-MYC四个慢病毒，具体包装步骤详见汉恒生物公司病毒包装步骤。您也可联系汉恒生物市场专员直接购买HanbioTM的ips系列病毒产品。

注：

1.小鼠的IPS可用小鼠和人的4因子进行诱导，而人的基因推荐使用人的4因子进行诱导，虽然也有人的细胞用小鼠4因子诱导成功的先例，但由于human细胞的调控机制更加复杂，失败的风险会进一步上升。

2. 汉恒生物已构建好全面的ips系列因子的各种病毒或非病毒载体：包括慢病毒，逆转录病毒，腺病毒，质粒载体等（单因子多个质粒和多因子单个质粒）。另外，我们的技术工程师拥有丰厚的ips建系及维护经验，随时欢迎咨询。

（三）小鼠IPS诱导方法

Feeder细胞和病毒都准备好后，则可以开始iPS的诱导，首先需要用0.1%gelatin预包被所要用的培养皿，包被时间约10min。

待细胞生长良好时，用0.25%胰酶消化，收集到一个15ml离心管中，进行细胞计数，在十二孔板的每个孔中加入4x105个左右的细胞，其中两个孔中的细胞用于作对照，比较转染的效率以及逆分化的效率。

等细胞长到汇合度为70%，加入新鲜的病毒液，根据细胞数量混合好所需的病毒（含有OCT4, SOX2-, KLF4- and c-MYC基因的病毒），将四个病毒按同等量混匀后，用0.45um过滤器过滤以除去其中的细胞碎片等杂质，避免对后续实验的影响。

在过滤好的病毒混合液中加入5ul浓度为10ug/ml的助转剂ploybrene，混匀后加入目的细胞的培养上清中。

病毒感染24h后，将感染的细胞消化下来，铺到事先处理好的MEF细胞上（六孔板约5000/well），第二天，将培养基换成ESC培养液（LIF 10 ng/ml），继续培养，以后每2天换液一次。

逐日观察，待细胞长至第5-7天后， 可见小的细胞聚集，细胞形态已经明显发生了改变，由梭形变圆形，生长聚集到一起。

一周后，MEF使用时间过长，需要重新更换新鲜的制备好的MEF，将进行诱导的细胞按1：10比例传代至新制备好的MEF上继续生长。

待细胞长至半个月左右，可以挑克隆，将ES样的克隆挑至新的MEF上，按ES的培养方法继续培养，扩增即可。       

（四）人IPS诱导方法

1. Feeder法

人IPS诱导中需要的Feeder细胞分离、培养方法以及病毒包装过程同小鼠ips诱导，不同的是IPS的具体诱导方法。

病毒收集好后，就可以进行病毒感染目的细胞，从而进行ips的诱导了，首先要将细胞进行铺板，保证细胞的浓度为8x104个/ml,单个10cm培养皿中植入8x105个细胞，然后将细胞静置于37度培养箱中进行培养过夜。

将带有OCT4-, SOX2-, KLF4- and c-MYC四个基因的病毒混合均匀，并在其中加入浓度为10ug/ml的助转剂ploybrene，使得终浓度为4 μg/ml，均匀混合好。

吸取目的细胞中的培养基，加入病毒混合液，并加入新鲜培养基补充至10ml，将细胞静置于37度培养箱中4h或者过夜，进行换液。

感染结束后，将细胞转移到铺有Feeder细胞的培养皿中继续培养，并换为人ES细胞培养液，并每天换液。

观察细胞生长状态，直到能观察到明显的细胞克隆产生，一般在20几天可以观察到成熟的细胞克隆。

当成熟的克隆形成后，将具有良好ES特征的克隆挑至另外一个铺有处理好的Feeder细胞的培养皿中继续培养。

2. Feeder free 法（单层培养）

   病毒感染过的human来源细胞，接种至铺了Matrigel（BD）的6cm培养皿中（约50000-100000/well），加入mTeSR1培养液, 持续培养，每两天换液一次，至克隆形成用巴氏管（普通巴氏管酒精灯加热后拉伸，头部要圆）将克隆划成小块，挑出成熟克隆扩大化培养。

四、ips的检测

1. 提取ips克隆RNA，RT-PCR检测四因子表达情况（PCR引物序列暂不对外提供，如有需要请联系汉恒生物）；

2. 免疫组化检测全能型marker；

3. ALP染色检测细胞全能性。

Reference：

1. Jia, F. et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nat. Methods 7, 197–199 (2010).

2. Kaji, K. et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature 458, 771–775 (2009).

3. Nakagawa, M., Takizawa, N., Narita, M., Ichisaka, T. & Yamanaka, S. Promotion of direct reprogramming by transformation-deficient Myc. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 14152–14157 (2010).

4. Morita, S., Kojima, T. & Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Ther. 7, 1063-6 (2000)   

5. McMahon, A. P. & Bradley, A. The Wnt-1 (int-1) proto-oncogene is required for development of a large region of the mouse brain. Cell 62, 1073-85. (1990)  

6. Fujioka, T. et al. A simple and efficient cryopreservation method for primate embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 48, 1149-54 (2004)  

                                                                                                           图示：成纤维细胞（转染之前）

                                                                                                              图示：成纤维细胞（转染之后第一天）

                                                                                                                图示：克隆样细胞（转染之后第21天）