ips操作指南-腺病毒文件下载

iPS操作指南--腺病毒

iPS简介：

 iPS细胞是通过基因转染技术（gene transfection）将某些转录因子导入动物或人的体细胞，使体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stemcell,ESC）细胞样的多潜能细胞。现在大多是通过病毒携带特定的转录因子进入体细胞内，来获得多能性干细胞。2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。

用Retrovirus、Lentivirus诱导IPS成功的例子已经非常多，但是由于retrovirus和lentivirus的基因组整合性，往往伴随基因组的破坏与癌化。用Lentivirus和retrovirus建立的IPS子宫移植繁衍而成的克隆鼠往往都伴随着肿瘤的高发生率。Adenovirus（腺病毒）是一类滴度极高，不整合基因组，可以简单实现高效感染的病毒载体，近年来以Adenovirus介导的IPS诱导已被证实成功且安全。

一、实验材料

腺病毒OSKM四因子： Ad-OCT4、Ad-SOX2、Ad-KLF4和Ad-c-MYC（来自汉恒生物，HanbioTM）；

病毒扩增细胞：293A细胞（来自汉恒生物，HanbioTM）；

ES Feeder细胞：MEF（C57）（来自汉恒生物，HanbioTM） 。

二、实验仪器和耗材

（一）实验仪器

 二级安全柜、37度培养箱、4度冰箱、液氮储存器、倒置显微镜、低温离心机。

（二）实验耗材

 PBS、无菌水、明胶粉、DMEM培养基、FBS、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、胰酶、血清替代物（SR）、mTESR1、T75培养瓶、无菌水、15ml离心管、50ml离心管，巴氏管等。

三、ips诱导方法

（一）Feeder细胞

1、Feeder细胞的分离（MEF）

   取妊娠13.5-14.5d的孕鼠，在无菌情况下取出胎鼠，去除鼠头，尾，四肢及内脏，然后用PBS进行冲洗。

   将胎体剪碎成小于1mm2的组织块，1000rpm，3min，去掉上层PBS，加入0.25%胰酶-0.04%EDTA 2~3ml浸泡组织块，常温消化2~3min。

   轻微吹打，待较多细胞溢出后，加入等量的10%FBS DMEM终止消化，通过100目滤网过滤后，将获得的液体离心，1000rpm，5min。

   弃上清，加入培养基重悬细胞，调整细胞密度约2x105个/ml，用10%FBS的DMEM进行培养。

2、MEF细胞的传代培养

   在倒置显微镜下观察，当成纤维细胞汇合度达到80%~90%时，去掉培养基，用PBS清洗两遍，加入2ml 0.25%胰酶-0.04%EDTA消化液进行消化。

   镜下观察，当细胞间出现裂隙，细胞变圆时，加入等量的MEF培养液终止消化，并用滴管反复轻轻吹打成单细胞悬液。

   将单细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm离心5min，弃上清，加入MEF培养液将细胞重悬，按1:2~3传代。置于37度、5%CO2培养箱中培养。

3、Feeder制备

   选择对数生长期的MEF，在培养基中加入丝裂霉素C在37度，5%CO2条件下处理2~3h，加入的丝裂霉素C浓度为0.4mg/ml, 使得终浓度为12ug/ml.

   处理结束后，吸取带有丝裂霉素C的培养基，用PBS清洗细胞两次后，加入0.25%胰酶-0.04%EDTA覆盖细胞表层，37度孵育6mins。

   用含有血清的培养基终止胰消化，然后将细胞重悬，吹散，细胞计数，按每个6cm dish中放入4x105个细胞或3x104个细胞每cm2分放，加入适量培养基，置于培养箱中备用。

   注：至少要放置2h后才可植入ES细胞。

（二）腺病毒的扩增：

    1）按每个75cm2方瓶中接种4×106 293细胞，接种6个75cm2培养瓶，培养过夜，待细胞生长满至90%时，加5ul病毒液接种培养瓶内，感染24-72小时，待显微镜下观察发现有60%细胞病       变。

    2）吹起细胞，收获病变细胞混悬液后，2000rpm离心5分钟，离心，弃培液上清，加入4ml ST buffer（培养液+10%血清+2.5%甘油），votex混匀，于-80℃和37℃间冻融三次，                  3000rpm离心5min取上清，分装后保存于-80℃保存待用。

（三）小鼠IPS诱导方法

   Feeder细胞和病毒都准备好后，则可以开始iPS的诱导，首先需要用0.1%gelatin预包被所要用的培养皿，包被时间约10min。

   待细胞生长良好时，用0.25%胰酶消化，收集到一个15ml离心管中，进行细胞计数，在十二孔板的每个孔中加入3x105个左右的细胞，其中两个孔中的细胞用于作对照，比较转染的效率以及逆   分化的效率。

   等细胞长到汇合度为70%（约5x105），移除旧的细胞培养基，根据不同的孔板差异，加入1/2体积的新鲜培养基。

注：参见下表《病毒小培养体积感染表》中“病毒感染对应细胞培养液体积”，如12孔板一般培养时加1ml培养基，在此只加入0.5ml，这是为了进行小体积的病毒感染，病毒感染时，培液的体积越小，病毒接触到细胞越容易，因此感染的效率也越高。

   对于polybrene不敏感的细胞，可在细胞中加入终浓度5ug/ul的polybrene先处理30min，然后根据细胞数量，分别加入所需的病毒（Ad-OCT4, Ad-SOX2-, Ad-KLF4、 Ad-c-MYC），每个病毒   的MOI值大约在50～100间，具体可参见附录1《汉恒生物腺病毒感染复数（MOI）与体积对应表》。

 病毒感染2h后，移除感染病毒体系，加入新鲜正常体积培养体系。（参见上表《病毒小培养体积感染表》中“对应细胞培养液体积”）。

 病毒感染24小时后，将感染的细胞消化下来，铺到事先处理好的MEF细胞上（六孔板约5000/well），第二天，将培养基换成ESC培养液（LIF 10 ng/ml），继续培养，以后每2天换液一次。

 逐日观察，待细胞长至第5-7天后， 可见小的细胞聚集，细胞形态已经明显发生了改变，由梭形变圆形，生长聚集到一起。

 一周后，MEF使用时间过长，需要重新更换新鲜的制备好的MEF，将进行诱导的细胞按1：10比例传代至新制备好的MEF上继续生长。

 待细胞长至半个月左右，可以挑克隆，将ES样的克隆挑至新的MEF上，按ES的培养方法继续培养，扩增即可。       

（四）人IPS诱导方法

  1. Feeder法

  人IPS诱导中需要的Feeder细胞分离、培养方法以及病毒包装过程同小鼠ips诱导，不同的是IPS的具体诱导方法。

  细胞种植及病毒感染与小鼠IPS诱导一致。

  感染结束后，将细胞转移到铺有Feeder细胞的培养皿中继续培养，并换为人ES细胞培养液，并每天换液。

  观察细胞生长状态，直到能观察到明显的细胞克隆产生，一般在20几天可以观察到成熟的细胞克隆。

  当成熟的克隆形成后，将具有良好ES特征的克隆挑至另外一个铺有处理好的Feeder细胞的培养皿中继续培养。

2. Feeder free 法（单层培养）

   病毒感染过的human来源细胞，接种至铺了Matrigel（BD）的6cm培养皿中（约50000-100000/well），加入mTeSR1培养液, 持续培养，每两天换液一次，至克隆形成用巴氏管（普通巴氏管酒精灯加热后拉伸，头部要圆）将克隆划成小块，挑出成熟克隆扩大化培养。

四、ips的检测

1. 提取ips克隆RNA，RT-PCR检测四因子表达情况（PCR引物序列暂不对外提供，如有需要请联系汉恒生物）；

2. 免疫组化检测全能型marker；

3. ALP染色检测细胞全能性。

注：

1.小鼠的IPS可用小鼠和人的4因子进行诱导，而人的基因推荐使用人的4因子进行诱导，虽然也有人的细胞用小鼠4因子诱导成功的先例，但由于human细胞的调控机制更加复杂，失败的风险会进一步上升。

2. 汉恒生物已构建好全面的ips系列因子的各种病毒或非病毒载体：包括慢病毒，逆转录病毒，腺病毒，质粒载体等（单因子多个质粒和多因子单个质粒）。另外，我们的技术工程师拥有丰厚的ips建系及维护经验，随时欢迎咨询。

3. 发表文章请注明使用汉恒生物IPS系列产品（HanbioTM  IPS SYSTEM）。

Reference：

1. Jia, F. et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nat. Methods 7, 197–199 (2010).

2. Kaji, K. et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature 458, 771–775 (2009).

3. Nakagawa, M., Takizawa, N., Narita, M., Ichisaka, T. & Yamanaka, S. Promotion of direct reprogramming by transformation-deficient Myc. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 14152–14157 (2010).

4. Morita, S., Kojima, T. & Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Ther. 7, 1063-6 (2000)   

5. McMahon, A. P. & Bradley, A. The Wnt-1 (int-1) proto-oncogene is required for development of a large region of the mouse brain. Cell 62, 1073-85. (1990)  

6. Fujioka, T. et al. A simple and efficient cryopreservation method for primate embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 48, 1149-54 (2004)  

7. Tashiro K, Kawabata K, Inamura M et al. Adenovirus vector-mediated efficient transduction into human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 2010;12:501-507.

8. Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, Weir G, Hochedlinger K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science 2008;322:945-949.

9.Zhou W, Freed CR. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells 2009;27:2667-2674.