慢病毒感染目的细胞步骤及注意事项
(一) 细胞准备
将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为1×105/ml细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%之间。
(二) 病毒感染
1. Polybrene的选择：
Polybrene是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10倍。
Polybrene有一定的细胞毒性，有的细胞对Polybrene的毒理反应明显，因此细胞感染时是否适合Polybrene需要摸索；不同细胞对Polybrene的敏感度不同，可以用1～10μg/ml的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞无明显毒性反应为佳，可参考文献并进行预实验摸索，Polybrene最常用的工作浓度为6～8 μg/ml。
注：1）汉恒生物的自产的Polybrene 产品，用户可用以进行辅助感染。提供的Polybrene母液保存在-20℃（可保存1年以上），避免反复冻融3次以上，否则活性受影响。4℃可保存2周。
2）Polybrene预实验请先使用对照病毒进行摸索，部分细胞系MOI及Polybrene 的使用范围请参见附表3。
2. 感染细胞最佳MOI的测定
MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。对于分裂活跃的细胞，比如Hela、293细胞，MOI=1～3时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行MOI梯度摸索实验，选择适合的MOI进行实验。
3. 感染步骤
按实验需要将细胞铺板（比如12孔板）。细胞数以第2天密度约50%为宜。37℃ 培养过夜。
对于Polybrene可施加的细胞：准备完全培养基和 Polybrene混合物，Polybrene 终浓度为摸索得到的最适终浓度。移去培养基并添加 0.5 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于 24 孔板，其他孔板请相应调整体积。）
注：对于不适用Polybrene的细胞，以上步骤省略，直接进入下面步骤。
感染前，从冰箱取出并在冰上慢慢融化病毒，吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基，再将病毒原液加入细胞中，轻轻混匀。（具体加入的病毒数可参考附表1）37℃小体积感染4 h，4 h后补齐培养基至正常体积。（感染时培养基体积表格如下）
病毒小培养体积感染表 | |||
培养皿类型 | 表面积/cm2 | 培养基体积 | 病毒体积 |
96-well | 0.3 cm2 | 100 µl | 50 µl |
24-well | 2 cm2 | 500 µl | 250 µl |
12-well | 4 cm2 | 1 ml | 500 µl |
6-well | 10 cm2 | 2 ml | 1 ml |
慢病毒感染4 h后补足至培养体积，感染24 h后换液，腺病毒感染4-8 h后直接换液 | |||
感染后第二天（约24 h），吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养。
感染后48 h，对于带GFP报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测GFP表达效率，对于携带Puromycin抗性基因的病毒，换上含适当浓度Puromycin的新鲜完全培养液，筛选稳定转导的细胞株（详见下方）。
注意： 融化的病毒置于冰上。反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。
4. Puromycin抗性筛选
Puromycin标准的施加终浓度范围为1～10 μg/ml，不同细胞puromycin的工作浓度不同，请查找相关文献（部分细胞参考用量见下图），另外请设不感染筛选对照（未经过病毒感染的野生型细胞），加入等量等浓度的Puromycin。
部分细胞Puromycin参考值：
Cell line | Species | Puromycin (µg/ml) |
293系列 | Human | 3 |
HeLa | Human | 3 |
B16 | Mouse | 1-3 |
PC1.0 | Hamster | 10 |
MC3T3-E1 | Mouse | 10 |
H9C2 | Rat | 1 |
MCF-7 | Human | 1-3 |
MDA-MB-××× | Human | 1-3 |
HepG2 | Human | 2 |
HT1080 | Human | 1 |
A549 | Human | 1.5 |
H1299 | Human | 2 |
Human embroyonic stem cells（Human ESCs） | Human | 1 |
更多Puromycin使用浓度更新中，详情请参考公司网站www.hanbio.net.
每2-3天更换一次含有Puromycin的完全培养液，直至没有感染病毒的对照组细胞被Puromycin杀光，然后可进行以下两步操作（依照具体实验需要选择）。
1) 不挑取单克隆
将感染并筛选后的细胞进行传代，并继续施加Puromycin进行维持性筛选培养。连续筛选并传3代后，冻存保种细胞Mixture（这种Mixture由于各个细胞的不均一性，有时候表型可能不是太好，建议做单克隆挑取）。
2) 挑取单克隆
将感染并筛选后的细胞挑选至少5个克隆进行细胞扩增，并继续施加Puromycin进行维持性筛选培养。扩增完毕后Western blot或者qPCR检测目的蛋白或基因的表达。挑取表达量适中的稳定细胞株，连续筛选并传3代后，冻存保重稳定细胞株。
5. 感染悬浮细胞
感染悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后，低速（200´g）离心1 h，然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置15 min（尽量不要超过30 min），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜后换液即可。
6. 对于极难感染的细胞
对于极难感染的细胞，如DC（树突状细胞）等，可采用多次感染的方法，即感染24 h后，更换新鲜病毒进行二次感染，可显著提升感染效率。
7. 传代能力较差的原代细胞
对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用滴度更高的腺病毒进行感染。
- 浏览 21344 次
