慢病毒载体使用中的问题及解答（FAQ）
1、对照病毒或目的病毒感染细胞以后，细胞形态发生改变或者细胞死亡，是否说明病毒有毒性?
RE：首先，确定病毒是否有污染；
1）细菌污染 病毒用Millipore 0.22um滤器过滤去除细菌；
2）真菌污染 病毒直接丢弃
3）支原体污染 细胞间质有黑点，黑点运动状，寄送抗支原体试剂试用装
4）细胞碎片 感染后换液几次去除细胞碎片
其次，确定病毒感染MOI是否过高，梯度稀释后感染，寻找合适的MOI。
同时考虑目的细胞可能比较敏感，更换其它细胞感染确定病毒是否有问题。病毒对某些敏感细胞有毒性可能是不可避免的。
如果以上都排除后细胞状态仍然不好，尝试增加血清含量，观察细胞状态是否好转。
2、病毒感染目的细胞感染不上或效率低？
RE：病毒感染效率和以下几个因素有关，
1）病毒活性 解冻病毒一定要在冰上进行，尽量避免反复冻融，冻融会影响病毒滴度。-80℃保存半年以上需要重新测滴度；
2）目的细胞 最好预实验测试过，看病毒载体是否合适感染目的细胞。一些难感染的细胞，如贴壁不好的细胞，原代细胞等，或者体内动物实验适合用腺病毒；
3） MOI值 一般来说MOI都是要用梯度法来摸索的，不同的病毒感染不同的细胞的MOI值也不一样，如果感染细胞所用的病毒量不够的话，感染效果肯定不好；需要确认MOI计算及细胞计数的准确性。
4） 感染时间 慢病毒/逆转录病毒一般在感染后24h换液，感染后换液太早会导致感染效率下降；感染后换液太晚，则对细胞的损伤太大，效率也不高。感染后48h开始观察荧光，由于慢病毒的表达时间较长，有的72h、120h才能看到荧光。
5）助转剂 polybrene是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常polybrene的加入能提高感染效率的2-10倍。Polybrene有一定的细胞毒性，有的细胞对polybrene的毒理反映明显，因此细胞感染时是否添加polybrene需要摸索，不同细胞对polybrene的敏感度不同，可以用1-10ug/ml的范围筛选合适的浓度,以24h内细胞无明显毒性反应为佳,可参考文献并进行预实验摸索。
6）荧光显微镜 确定荧光显微镜是否处于最佳状态。
PS：慢病毒带puromycin抗性的可以用嘌呤霉素筛选，也可提高阳性细胞率。
3、为什么过表达慢病毒载体比对照的荧光要暗？
RE：每种病毒有自己的载体容量，基因的插入，会影响位于其下游的荧光蛋白等基因的表达。
对照病毒或干扰病毒，由于没有插基因或者插入基因非常短，荧光会强。而插入了较长基因之后，荧光的亮度会随着插入基因的长度以及特殊结构的存在等而减弱，尤其是出现高GC片段。由于影响了转录，荧光强度会大大降低。因此不能将过表达病毒的荧光和对照病毒荧光进行比较，荧光较弱不等同于病毒的滴度差。
PS：观察荧光时最好关掉室内灯光，只留荧光显微镜光源。
4、要曝光很长时间才能观察到荧光？
RE：要曝光很长时间才能观察到荧光，说明荧光比较弱，可能的原因有：
①显微镜汞灯使用时间长，这个可以通过对照排除，看是否有比较亮的对照，或者如果有其它比较亮的样品，证明不是汞灯的问题；
②pH值低，看培养基是否发黄导致绿色荧光淬灭
③目的病毒光不亮 插入目的基因后的病毒荧光强度会相较对照弱一些，这个属于正常现象，曝光时间被对照稍加长些，看感染上的阳性细胞比例如何，同时感染一下对照，看看目的和对照的荧光的差异，如果感染比例尚可，差异不是很大，用purmycino筛选有大量细胞存活，则病毒也可以使用。
5、QPCR有效果，但是WB效果不高/没有？
1）跨膜蛋白，一般的裂解方法较难完全裂解，难检测到蛋白的表达。可推荐使用我们公司的裂解方法
2）检测标签表达，确认标签是否表达，标签是外源性的，更容易检测到。
3）WB直接检测目的蛋白，受到抗体的质量（包括抗体有效性和灵敏度）操作等影响较大。另外，由于每个客户的目标基因，转染的细胞都不同，比如基因翻译受阻，或者出现代偿性上升/下调等都会导致WB检测不到。
6、过表达病毒感染后，QPCR没有过表达？
RE：首先应可通过荧光或筛选标记来判断感染效率，感染效率最好到50%以上。
第二，确认引物序列是否正确，平时碰到最多的情况，是客户用的引物为primerbank等数据库中查询的，引物位于基因的UTR区，而我们过表达病毒克隆的是ORF区，用这样的引物不能检测出来。也可以建议客户PCR的产品跑个电泳，看看PCR产物对不对。会不会是非特异性扩增。也可以看下引物的GC含量是否很高。
第三，如果以上两点均正确，那么检查一下QPCR的数据，包括溶解曲线是否80℃以上的单峰（80℃以下很多为引物二聚体峰），以及ct值的情况，复孔是否均匀，目的基因的ct值和内参的δct是多大，有些丰度很高的基因，本身内源性表达量就已经接近或者超过内参了，过表达量就比较难提升很高倍数（因为QPCR的过表达倍数是相对量，如果内源性低过表达倍数就会很高，如果内源高，过表达倍数就容易显低）。
7、WB条带位置跟理论不同的解释：
RE：蛋白发生如磷酸化、糖基化等翻译后修饰时条带会上移，蛋白发生剪切（如前体）时条带会下移，蛋白存在不同的可变剪切体或亚型，强相互作用大分子存在时变性不彻底。
8、为什么做western用flag检测有过表达，用目的蛋白的抗体检测没有过表达？
RE：这种情况存在以下几种可能
① 两种抗体灵敏度不同
② 过表达量被本底表达掩盖（基因在细胞中本身有较高的内源性表达量，过表达之后用目的蛋白抗体WB检测到的条带比本底的浓度只大一点因此并不明显，如果上样浓度再有些不一致就会被掩盖掉。而flag抗体是有或无的区别，因此能明显看出来。）
③ ORF出现突变或移码，表达的不是目的蛋白。这个可以通过检查测序结果和对照flag抗体做出的条带大小来初步排除。测序结果没有突变，而flag检测到的蛋白和理论大小差不多，证明ORF能正常翻译，出现移码的可能性不大。
④ 基因有多个转录本，目的蛋白抗体只能检测到其中某一种或几种表达形式，检测不到过表达的这个转录本形式（可以查看一下抗体的抗原表位，看理论上是否能结合）。
9、做了3条干扰，下调效果不好（我们的干扰一般是保证70%的下调效率）？
RE：
1）确认感染效率（如果客户没有用抗性筛过的话）。干扰和过表达不同，过表达可能有30%或者50%的感染率，就能有数倍的过表达（相对内源性表达是成倍提升）。但干扰的效率很大程度上决定于感染效率（假设siRNA的下调效率是80%，但只有50%的细胞感染上，那整体水平上来说，至多只有40%的下调效率）。
2）确认QPCR数据，
①先检查QPCR引物是否有问题，干扰的不需要在ORF区，但是我们设计的位置主要在CDS区，最好用CDS区的引物来检测，比对一下看种属基因是否正确。
②其次看溶解曲线峰图，是否平滑是否有杂峰，是否峰在80℃以下，如有以上情况可能PCR结果不准确。
③看CT值，复孔之间是否均一，因为干扰不像过表达好做，干扰对复孔均一性要求很高，如果复孔间误差超过1，计算后就会造成50%左右的下调误差，非常严重。除复孔均一性外，也要注意ct值大小，有些基因内源性表达极低，ct值接近或超过30，这种低表达的基因再去做下调，本身意义不大，属于前期实验设计问题，建议更换靶细胞。
3）如果qPCR下调效率达不到70%，达到50%左右对下游也可能有调控的，但是qPCR结果要有显著性。建议可以看一看后续实验有没有结果。
10、RNA干扰：如果我的基因 设计了6条干扰序列都无效果，可能是什么原因？有什么解决办法吗？
RE：
1）可以尝试用puromycin等筛选一下试一试；或者是过表达之后knockdown，看基因是不是有下调。
2）我们根据专业网站进行干扰靶点预测，理论上分值（即星级）越高，干扰效果越好，因此我们优先选择分值最高的三条序列进行构建。然而软件预测结果和实际的实验结果未必完全一致，如果6条都无效，很有可能该基因就不适合使用shRNA干扰方式进行敲减。
11、siRNA效果很好，但是包成shRNA病毒后，下调效果变差，是不是基因没有包进去？
RE：siRNA和shRNA在结构上是不一样的，siRNA为化学合成，使用浓度一般为5uM，浓度非常大，瞬时转染时如果细胞转染效率尚可，瞬时进入细胞中的分子数非常多（超过8次方），并且不需要经过剪切加工过程就可以和靶点结合，因此非常容易起效果，1条有效的概率接近90%.
shRNA不同，是将干扰基因克隆到DNA上，经过病毒整合（慢病毒）或者非整合（腺病毒，腺相关病毒）进入到细胞内后，经过转录，变成发夹RNA，再经过胞内一系列酶的剪切加工后，才能变成可以和靶点结合的干扰RNA。这个过程中因为拷贝数低（如慢病毒需要整合基因组），转录加工过程复杂，因此比较难起效果，即便同时做3条，也有约10%的可能性会出现3条干扰效率都低下的情况。另外，单从碱基数上来说，siRNA一般为19nt，而我们设计shRNA时，一般长度为21nt或25nt，所以有效的siRNA，往往有可能会出现并不合适做成shRNA的情况。
12、miRNA sponge 没有效果？
RE：确认感染效率，收样时间（一般48h能有效果）。mirRNA sponge作用机理为竞争性结合mirRNA，不会导致mirRNA降解，因此建议通过检测mirRNA作用靶点的方式验证mirRNA sponge的功能。
13、慢病毒筛选稳转株之后，培养一段时间检测没有过表达（干扰）效果？
RE：慢病毒感染细胞用puro筛选得到稳转株之后，需要一直用含有puro的培养基去培养细胞，以免出现基因丢失的情况。建议后期培养浓度可以按照1/10-1/2的筛选浓度来。
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