介绍：RNAFit是一种功能强大的siRNA / miRNA转染试剂，可确保在哺乳动物细胞中进行有效的转染和基因沉默，并且具有高重复性的结果。在绝大多数的细胞（如HeLa，MCF7或NIH-3T3）中使用RNAFit转染1 nM siRNA，就能达到超过90％的转染效率；对于难以转染的悬浮细胞系如K562或THP-1细胞，使用RNAFit转染终浓度为5 nM的siRNA，也可以观察到超过80％的转染效率。
1、贴壁细胞转染siRNA操作步骤
1.1接种细胞
为了使用RNAFit转染贴壁细胞取得最佳的转染效果，需要提前一天将细胞接种到相应的培养板中，以转染时细胞汇合度达到30-50％为宜。（推荐接种的细胞数量参见表1）
表1.转染前一天推荐接种的细胞数
培养板规格 | 接种细胞数量 | 每孔表面积 | 培养基体积 |
96-well | 5 000 ± 2 500 | 0.3cm2 | 0.2 ml |
24-well | 25 000 ± 10 000 | 1.9 cm2 | 1 ml |
12-well | 50 000 ± 20 000 | 3.8 cm2 | 2 ml |
6-well / 3.5 cm | 150 000 ± 50 000 | 9.4 cm2 | 4 ml |
6 cm 培养皿/25cm2培养瓶 | 400000 ± 100000 | 25 - 28 cm2 | 8 ml |
10 cm培养皿 / 75 cm2培养瓶 | 1 x 106 ± 250 000 | 75 - 78.5 cm2 | 15 ml |
14 cm培养皿 / 175 cm2培养瓶 | 2 x 106 - 5 x 106 | 153 - 175 cm2 | 20 ml |
1.2 贴壁细胞转染
为了达到高的基因沉默效率，我们建议siRNA浓度范围为1 nM至10 nM，因为最佳siRNA浓度和靶基因本身、细胞类型、siRNA效力、靶mRNA的半衰期等有很大关系。需要注意的是，在较低的siRNA浓度下，脱靶率通常最低。 RNAFit的用量应根据siRNA浓度和培养皿规格进行调整，见表2。
注意：
1.转染前确认好 siRNA 的大小和纯度。
2.避免 RNase 污染，微量 RNase 就会导致 siRNA 实验失败。需要使用无RNase的耗材及试剂，保证实验每个步骤不受RNase污染非常重要。
1.2.1转染1nM siRNA的操作步骤
以下步骤用于在24孔板中转染1nM siRNA双链体，如使用其他规格的培养皿进行转染，可参见表2。
1）将0.6 pmoles（8.4 ng）的siRNA双链体稀释到100 μl无血清的培养基中或Opti-MEM中，用移液枪轻轻吹打 3~5 次混匀。
2）向上述100 μl 含siRNA的培养基中加入2μl RNAFit。
3）加入RNAFit后立即涡旋振荡10秒钟，进行混匀。
4）在室温下孵育10分钟，使siRNA双链体和RNAFit之间形成转染复合物，不要超过30分钟。
5）在转染复合物形成期间，吸弃培养皿中原有的培养基，并向每孔中重新加入0.5 ml预热的新鲜的完全培养基。
6）将步骤4中的100 μl转染复合物加入 24 孔细胞板中，前后轻摇细胞板混合均匀。每孔中培养基的最终体积为600 μl，siRNA终浓度为1nM。
7）细胞板置于 37℃、5% CO2培养箱中培养。
8）转染完成后 24~72 小时均可通过 qPCR 和Western Blot 进行 siRNA 沉默效果检测。
表2.1nM siRNA时各种细胞培养容器的推荐转染条件
培养板规格 |
siRNA（pmoles）/孔 |
siRNA（ng）/孔 |
RNAFit 体积 |
无血清培养基体积 |
完全培养基体积 |
总体积 |
96-well | 0.17 | 2.4 ng | 0.75 ± 0.5 µl | 50 µl | 125 µl | 175 µl |
24-well | 0.6 | 8.4 ng | 2 ± 1 µl | 100 µl | 500 µl | 600 µl |
12-well | 1.2 | 17 ng | 4 ± 2 µl | 200 µl | 1 ml | 1.2 ml |
6-well /3.5 cm | 2.2 | 31 ng | 8 ± 4 µl | 200 µl | 2 ml | 2.2 ml |
6 cm / 25 cm2培养瓶 | 4.4 | 62 ng | 15 ± 5 µl | 400 µl | 4 ml | 4.4 ml |
10 cm / 75 cm2培养瓶 | 10.5 | 147 ng | 40 ± 10 µl | 500 µl | 10 ml | 10.5 ml |
1.2.2转染10nM ~50nM siRNA的操作步骤
当siRNA浓度范围为10至50 nM时，请使用表3中所示的推荐条件。
表3.10至50nM siRNA时不同细胞培养容器中转染贴壁细胞的推荐条件
培养板规格 | RNAFit体积 | 无血清培养基体积 | 完全培养基 体积 | 总体积 |
96-well | 1 ± 0.5 µl | 50 µl | 125 µl | 175 µl |
24-well | 3 ± 1 µl | 100 µl | 500 µl | 600 µl |
12-well | 6 ± 2 µl | 200 µl | 1 ml | 1.2 ml |
6-well / 3.5 cm | 12 ± 4 µl | 200 µl | 2 ml | 2.2 ml |
6 cm / 25 cm2培养瓶 | 20 ± 5 µl | 400 µl | 4 ml | 4.4 ml |
2、悬浮细胞转染siRNA操作步骤
2.1接种细胞
为了使用RNAFit转染悬浮细胞取得最佳的转染效果，与常规培养条件相比，应在转染当天减少培养基体积接种细胞。对于不同规格的培养板，建议接种的细胞数量及完全培养基体积可参见表4。
表4.在转染当天接种的悬浮细胞的数量
培养板规格 | 接种细胞数量 | 培养基体积 |
384-well | 5 000 - 10 000 | 25 µl |
96-well | 10 000 - 20 000 | 50 µl |
24-well | 100 000 - 200 000 | 200 µl |
12-well | 200 000 - 400 000 | 500 µl |
6-well / 3.5 cm | 500 000 - 2 x 106 | 1 ml |
6 cm / 25 cm2 培养瓶 | 2 x 106 - 5 x 106 | 2 ml |
2.2悬浮细胞转染
为了达到高的基因沉默效率，我们建议对siRNA浓度从5 nM至20 nM范围进行摸索，根据表5中所述的siRNA浓度，需要相应地调整RNAFit的体积。
表5.根据siRNA浓度和培养板规格推荐使用的RNAFit体积。
siRNA 终浓度 | 培养板规格 | RNAFit体积 |
1 to 20 nM | 384-well | 1 ± 0.5 µl |
96-well | 2 ± 1 µl | |
24-well | 3 ± 2 µl | |
6-well or 35 mm | 10 ± 8 µl | |
20 to 50 nM | 384-well | 1.5 ± 0.5 µl |
96-well | 3 ± 1 µl | |
24-well | 5 ± 2 µl | |
6-well or 35 mm | 15 ± 8 µl |
以下步骤用于在24孔板中转染5nM siRNA双链体，如使用其他规格的培养皿进行转染，可参见表6。
1）将1.5 pmoles（21 ng）的siRNA双链体稀释到100 μl不含血清的培养基中或Opti-MEM中，移液枪轻轻吹打3~5 次混匀。
2）向上述100 μl 含siRNA的培养基中加入4μl RNAFit。
3）立即涡旋振荡10秒钟，进行混匀。
4）在室温下孵育10分钟，使siRNA双链体和RNAFit之间形成转染复合物，不要超过30分钟。
5）将步骤4中的100 μl转染复合物加入 24 孔细胞板中，每孔中细胞悬液为200 μl，前后轻摇细胞板混合均匀。每孔中培养基的最终体积为300 μl，siRNA终浓度为5 nM。
6）细胞板置于 37℃、5% CO2培养箱中培养。
7）转染完成后 24~72 小时均可通过 qPCR 和Western Blot 进行 siRNA 沉默效果检测。
表6.悬浮细胞中5nM的siRNA转染的推荐条件
培养板规格 | siRNA（pmoles）/孔 | siRNA（ng）/孔 | RNAFit体积/孔 | 无血清培养基/孔 | 细胞悬液体积 | 4-6小时后加入培养基的体积 |
384-well | 0.25 | 3.75ng | 1 ± 0.5 µl | 25µl | 25µl | 0µl |
96-well | 0.5 | 7.5ng | 2 ± 1 µl | 50µl | 50µl | 100µl |
24-well | 1.5 | 21ng | 3 ± 2 µl | 100µl | 200µl | 0.7ml |
12-well | 3.5 | 49ng | 6 ± 4 µl | 200µl | 500µl | 1ml |
6-well / 3.5 cm | 6 | 84ng | 10 ± 8 µl | 200µl | 1ml | 2ml |
6 cm / 25 cm2培养瓶 | 12 | 168ng | 15 ± 10µl | 400µl | 2ml | 4ml |
3、 miRNA转染
在贴壁细胞中转染miRNA的操作步骤参见1.2；在悬浮细胞中转染miRNA的操作步骤参见2.2。
4、疑难解答
问题 | 解决建议 |
较低的沉默效率 | 增加每孔中siRNA浓度。 |
增加每孔中RNAFit的量。 | |
检测转染24h~96h的不同时间点的沉默效率。 | |
用opti-MEM稀释siRNA。 | |
确保贴壁细胞在转染当天汇合度达到30-50％。对于小细胞和生长缓慢的细胞类型，每孔中接种约2倍数量的细胞以达到足够的汇合度。 | |
确认所有试剂是否不含RNase。 | |
确保siRNA是高质量的（PAGE纯化和脱盐）。 | |
确认siRNA双链体的浓度和退火条件。 | |
将转染期间的培养基体积减少一半并低速离心培养板（180g，5分钟）。 4小时后，加入0.5毫升培养基。 | |
细胞毒性 | 通过在转染后4至6小时更换培养基或简单地向培养基中添加新鲜培养基，减少RNAFit/ siRNA复合物与细胞的孵育时间。 |
减少转染试验中使用的RNAFit的体积。 | |
核实沉默靶基因后是否不影响细胞活力。
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